一种鸡IL-18与新城疫病毒HN基因重组融合蛋白及应用

摘要

本发明涉及一种重组鸡白细胞介素18(Interleukin-18，IL-18)与新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)融合蛋白(chIL-18-HN融合蛋白)的制备方法和应用。该融合蛋白为鸡IL-18(chIL-18)蛋白和新城疫病毒HN蛋白通过柔性Linker肽融合而成，编码该融合蛋白的DNA序列插入表达载体pPICZαA，电转化酵母菌X-33，获得高效表达重组chIL-18-HN融合蛋白的基因工程菌，通过液体培养、纯化制得的重组chIL-18-HN融合蛋白，该重组融合蛋白可作为新城疫新型基因工程疫苗，也可作为新城疫常规疫苗的新型免疫佐剂。本发明的chIL-18-HN融合蛋白经动物免疫实验证实，安全性好，无毒副作用，能够有效增强机体细胞免疫和体液免疫水平，具有广阔的应用前景。

主权项

一种重组融合蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤： (1)chIL‑18‑HN融合蛋白编码基因序列的获得 禽IL‑18基因序列的获得 根据GenBank中禽IL‑18的核苷酸序列，利用DNA Star7.0、Primerpremier6.0软件设计一对特异性引物F1、F2扩增IL‑18，引物F15’端引入NotI内切酶位点，F25’端BamHI内切酶位点并同时引入柔性接头，引物序列如下： F1:SEQ ID NO.1， P1:5’‑GCGGCCGCGATGCCTTTTGTAAGGATA‑3’ F2:SEQ ID NO.2， P2:5’‑GGTGGATCCGGCGGTTCTGGCGGATTATAGGTTGTGCCTTTCATTATG‑3’ 将NDV‑I系疫苗做50倍稀释，通过尿囊腔接种于10日龄鸡胚，0.2mL/枚，37℃继续孵化，于接种后48‑72h取出未死的鸡胚，取脾脏无菌研碎，并立即进行总mRNA的提取和扩增，以鸡胚脾脏总mRNA为模板，RT‑PCR扩增鸡IL‑18基因，按一步法RT‑PCR的要求，在50μL反应体系中分别加入10×buffer 5μL，MgCl₂10μL，dNTP混合物5μL，RNA酶抑制剂1μL，反转录酶1μL，Taq酶1μL，上、下游引物F1和F2各2μL，模板5μL，无RNA酶水18μL；反应条件为：经50℃30min、94℃2min后，以94℃45sec、53℃90sec、72℃100sec的参数循环30次，最后72℃延伸10min；扩增的PCR产物经含有溴化乙锭1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后进行回收即为禽IL‑18基因片段； 新城疫病毒HN基因的获得 根据GenBank中新城疫病毒HN基因的核苷酸序列，收录号：GU573799.1，利用DNA Star7.0、Primer premier6.0软件设计一对特异性引物F3、F4扩增新城疫病毒HN基因，引物F35’端引入BamHI内切酶位点并同时引入柔性接头，F45’端引入KpnI内切酶位点，引物序列如下： F3:SEQ.ID.NO.3， P1:5’‑GGTGGATCCATGGACCGCGCCGTTAGC‑3’ F4:SEQ.ID.NO.4， P2:5’‑GGTACCACCGCCCTAGCCAGACCTGGCTTC‑3’ 将冻存的NDV毒株经37℃水浴融化后通过尿囊腔途径接种9～10日龄非免疫鸡胚，每个胚0.2mL，37℃孵化；无菌收集24～48h死亡鸡胚的尿囊液，经反复冻融3次后、 8000r/min 4℃离心15min，取上清液，20℃保存待用；病毒RNA的提取；以提取的总RNA4μL为模板，加入MgCl₂3μL，10×buffer 2.5μL，10mmol/L dNTP混合物2.5μL，20U RNA酶抑制剂0.5μL，反转录酶0.5μL，Taq酶0.5μL，引物F31μL，引物F41μL，灭菌dH2O 9.5μL，总体系25μL；按以下反应条件进行RT‑PCR反应：50℃40s，94℃2min后，以94℃45sec，53℃90sec，72℃100sec，循环32次，最后72℃延伸10min；PCR产物经含有溴化乙锭1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后进行回收即为新城疫病毒HN基因； chIL‑18‑HN融合蛋白编码基因序列的获得 以上述获得的禽IL‑18基因和新城疫病毒HN基因为模板，利用F1和F4引物，通过重叠延伸PCR方法扩增chIL‑18‑HN融合基因；PCR反应体系50μl：10×PCR Buffer 5μL，MgCl₂3μL，dNTP 10mmol/L 1μL，禽IL‑18基因和新城疫病毒HN基因作为模板各加入5μL，引物F1和引物F4终浓度为20pmol/L各2μL，TaKaRa ExTaq 0.5μL，灭菌超纯水，34.5μL；PCR反应条件：94℃预变性2min，进入PCR循环：94℃30s，52℃1min，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min；PCR产物经含有溴化乙锭1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后进行回收即为chIL‑18‑HN融合基因，如SEQ.ID.NO.5所示； (2)chIL‑18‑HN融合基因重组酵母表达载体的构建 应用Not I、Kpn I内切酶对上述chIL‑18‑HN融合基因PCR产物和毕赤酵母表达载体pPICZαA进行双酶切，酶切产物同样经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，进行回收鉴定；经过酶切的chIL‑18‑HN融合基因和毕赤酵母表达载体pPICZαA按1：3的摩尔比4℃过夜连接，取连接产物加入含有100μL感受态DH5α的聚丙烯离心管中，轻轻混匀后冰浴30min，将聚丙烯离心管从冰中取出后42℃热休克90sec，然后立即冰浴2min，加入800μL 37℃预热的LB培养基，于37℃下100～150rpm振摇45min；取100μL菌液均匀涂布含氨苄青霉素50μg/mL的琼脂LB平板，在37℃正置培养20min后，倒置培养16‑20h；碱裂解法提取质粒，对提取质粒进行Not I和KpnⅠ双酶切鉴定，以酶切出现2000bp左右大小DNA片段的质粒为阳性质粒，并将阳性质粒命名为pPICZαA‑chIL‑18‑HN； (3)表达chIL‑18‑HN融合蛋白的基因工程菌株的构建 取上述得到的阳性重组酵母表达载体pPICZαA‑chIL‑18‑HN进行SacI线性化，线性化的重组表达载体pPICZαA‑chIL‑18‑HN 5μg与80μL感受态毕赤酵母菌X‑33相混合，转移至预冷的0.2cm电转杯，置冰上5min，1.5kV、25μF、200Ω电击，立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，取200μL涂布于YPDS平板上，30℃培养至单菌落出现；采用PCR方法分析毕赤酵母转化子，用煮‑冻‑煮法制备PCR模板，用引物F1和F4：反应体系同上，PCR 反应条件：94℃5min；94℃45s，48℃45s，72℃45s，25个循环，72℃6min；鉴定扩增出大小为2200bp的克隆定为毕赤酵母阳性转化子，即为表达chIL‑18‑HN融合蛋白的基因工程毕赤酵母X‑33菌株； (4)重组chIL‑18‑HN融合蛋白的诱导表达 将筛选到阳性克隆X‑33/chIL‑18‑HN接种到10mL BMGY中，30℃250r/min振荡培养22h至OD600达2‑8，然后按10％的比例加到BMGY液体培养基中，于30℃，250r/min继续培养至OD600达2‑8，室温下静置4h，收集菌体，用等体积pH 6.0BMMY培养基重悬菌体，于30℃，250r/min的摇床上加入1.5％甲醇进行诱导表达，共培养120h，期间每24h补加终浓度为1.5％的甲醇；120h后，5000r/min离心10min收集培养液上清，即为获得的chIL‑18‑HN融合蛋白。