一种高灵敏度孕中期唐氏综合症产前筛查试剂盒及其制备和检测方法

摘要

本发明公开了一种高灵敏度孕中期唐氏综合症产前筛查试剂盒及其制备检测方法，所述试剂盒包括盒体，以及AFP和β-HCG包被板条、AFP和β-HCG标准品、AFP和β-HCG质控品、AFP和β-HCG酶结合物、标本稀释液、发光底物液、浓缩洗涤液等，制备方法包括制备AFP、β-HCG单克隆抗体包被板条，配制AFP、β-HCG标准品和质控品，制备AFP、β-HCG酶结合物，配制标本稀释液，配制发光底物液A和发光底物液B和配制浓缩洗涤液等步骤；本发明的优点在于：实现了孕中期唐氏综合症产前筛查的目的，与临床诊断符合率达99.7%以上，灵敏度高、特异性强，结果更准确可靠。

主权项

一种高灵敏度孕中期唐氏综合症产前筛查试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括盒体，以及设置在所述盒体内的AFP包被板条、AFP标准品、AFP质控品、AFP酶结合物、β‑HCG包被板条、β‑HCG标准品、β‑HCG质控品、β‑HCG酶结合物、标本稀释液、发光底物液A、发光底物液B、浓缩洗涤液；所述AFP包被板条和β‑HCG包被板条，为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板包被板条；所述酶标板的各孔包被有固相化的AFP单克隆抗体和β‑HCG单克隆抗体，上述单克隆抗体浓度1μg/mL；所述AFP标准品为浓度分别为：0 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40ng/mL的AFP标准溶液；所述β‑HCG标准品为浓度分别是：0 mIU/mL、2.5 mIU/mL、5 mIU/mL、10 mIU/mL、20 mIU/mL、40 mIU/mL的β‑HCG标准溶液；所述AFP质控品为浓度分别为：5 ng/mL、20 ng/mL的AFP溶液；所述β‑HCG质控品为浓度分别为：5 mIU/mL、20 mIU/mL的β‑HCG溶液；所述AFP酶结合物，为辣根过氧化物酶标记的与包被板条配对的另一株AFP单克隆抗体，双抗体夹心法需要一对抗体，一株用于包被，另一株用于标记，是针对蛋白不同表位的抗体，工作浓度为1: 1000；所述β‑HCG酶结合物，为辣根过氧化物酶标记的与包被板条配对的另一株β‑HCG单克隆抗体，工作浓度为1: 1000；所述标本稀释液为pH=7.0的0.01M 的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液，还含有体积分数10%小牛血清和0.1%硫柳汞，硫柳汞用于防腐，小牛血清使所检测样本保持同样的基质；所述浓缩洗涤液为含有体积分数分别为0.05%的吐温20、0.1%的硫柳汞的pH=7.5浓度0.1mol/L的磷酸盐缓冲液；所述发光底物液A为每250mL溶液含有N,O‑双三甲硅基乙酰胺（BSA）2.5g、三羟甲基氨基甲烷（Tris）1.5g、3‑氨基邻苯二甲酰肼（鲁米诺）0.05g、对位碘酚0.0075g，另外还有极少量盐酸，每1000mL底物液A加500µL盐酸，用作调节溶液的pH值至pH=9；所述发光底物液B为每250mL溶液含有BSA 2.5g、Tris1.5g、过氧化氢0.25mL，另外还有极少量盐酸，每1000mL底物液B加500µL盐酸，用作调节溶液的pH值至pH=9；上述试剂盒按照以下步骤制备：（1）AFP、β‑HCG单克隆抗体包被板条的制备a采用单克隆抗体技术，先使用AFP或β‑HCG纯品按常规对小鼠进行免疫，取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，加以筛选配对，建立AFP和β‑HCG单克隆抗体细胞库，然后再经接种小鼠腹腔制备腹水，再将腹水纯化后获得特异性为100％、纯度大于96%的AFP或β‑HCG配对单克隆抗体；b 预包被板的准备：预包AFP板的板条一头涂黄色，预包β‑HCG板的板条一头涂红色，以便区分；c AFP包被液的配制：用0.1mol/L碳酸盐缓冲液，配方：0.34g Na₂CO₃ + 0.57g Na₂HCO₃定容至100mL，将3mg/mL的AFP抗体溶液稀释成1µg/mL，pH=9.6；d β‑HCG包被液的配制：用0.1mol/L碳酸盐缓冲液将1mg/mL的β‑HCG抗体溶液稀释成1µg/mL，pH=9.6；f 包被量：AFP、β‑HCG包被板均按100µl/孔包被，待全部包被完毕，置2～8℃静止、吸附48小时；g洗涤：分别将上述包被后的板条用洗涤液洗涤两次，间隔10秒，在洁净纱布或吸水纸上拍干；h 封闭：分别将上述洗涤后的板条每孔加封闭液130µL，室温20～25℃封闭3小时；i 干燥：甩出板孔中的封闭液，18～25℃干燥48小时；j 分别将上述干燥后的板条装入铝箔袋，封口，2～8℃保存备用；（2）AFP、β‑HCG标准品、质控品的配制先将AFP、β‑HCG 冻干标准品溶解并稀释至所需的最高浓度，再采用倍比稀释法稀释至所需浓度；AFP、β‑HCG的S0标准品为未添加AFP、β‑HCG的标准品稀释液；（3）AFP、β‑HCG酶结合物的制备a 称取辣根过氧化物酶倒入一棕色小玻璃瓶内，取1mL双蒸水溶解，用加样器取200µL高碘酸钠溶液，滴入盛辣根过氧化物酶的小瓶内，室温振荡20min；b 振荡好的辣根过氧化物酶溶液取入透析袋，放入配制好的醋酸缓冲液中，4℃冰箱透析过夜；c 取待标记抗体加入另一透析袋中，放入配制好的碳酸盐缓冲液中，置于4℃冰箱内透析过夜；d 次日，取出辣根过氧化物酶溶液，和抗体混匀，放入碳酸盐缓冲液中搅拌透析3小时；e 将透析好的辣根过氧化物酶和抗体溶液，置于棕色小瓶内，加入硼氢化钠溶液充分混匀，用振荡器振荡2小时；f 将葡聚糖凝胶G‑200装柱，将上述标记物加于柱顶部，洗脱液洗脱；g 用小试管依次分段接收流出物，用事先包被好的羊抗鼠板条进行检测，取显兰色板孔对应试管内的酶结合物；h 将收集的酶结合物加入等量甘油混匀，甘油能更好的稳定酶结合物活性，放置于‑20℃冰箱保存；i、将酶结合物稀释到工作浓度，装入试剂瓶冷藏备用；（4）标本稀释液的配制用电子天平准确称量NaCl 7g、Na₂HPO₄12H₂O 2.8g、KH₂PO₄ 0.2g、KCl 0.2g加入容量瓶；先加适量纯水，轻摇使之溶解完全；再用电子天平准确称量硫柳汞0.5g，轻摇使之溶解完全；量取小牛血清200mL加入容量瓶，搅拌均匀，以纯水定容至1000mL，即得标本稀释液；（5）发光底物液A的配制  用电子天平准确称取BSA（N,O‑双三甲硅基乙酰胺）2.5g、Tris1.5g，加入容量瓶；加适量纯水，轻摇使之溶解完全，以纯水定容至250mL；再用HCl调节pH=9.0，完全混匀；再用电子天平准确称取鲁米诺0.05g、对位碘酚0.0075g，倒入容量瓶，充分溶解，摇匀；（7）发光底物液B的配制用电子天平准确称取BSA 2.5g、Tris1.5g，加入容量瓶；加适量纯水，轻摇使之溶解完全，以纯水定容至250mL；再用HCl调节pH=9.0，完全混匀；用加样器取0.25mL H₂O₂加入上述液体中，混匀；（8）浓缩洗涤液的配制用电子天平准确称量NaCl 150.9g、Na₂HPO₄.12H₂O 96g、NaH₂PO₄ .2H₂O 20 g加入容量瓶；先加适量纯水，轻摇使之溶解完全；再用电子天平准确称量硫柳汞1g，轻摇使之溶解完全；量取5mL吐温‑20加入容量瓶，搅拌均匀，以纯水定容至1000mL，即得浓缩洗涤液；上述试剂盒的检测方法，包括以下步骤：（1）样品收集抽取孕中期，14～21周，孕妇静脉血3mL，置一次性采血管内，于37℃水浴箱放置20～30分钟让纤维蛋白原充分凝固后，4000转/分钟离心15分钟，吸取血清；若血清标本不能及时检测，应‑20℃冻存，检测时应将标本融化后混合均匀，并避免反复冻融；血清标本4℃冰箱存放最好不要超过3天；（2）加样检测步骤AFP测定：a. 将在冷藏环境中贮藏的试剂室温平衡；b. 从铝箔袋中取出所需的微孔板条插入框架内，将不用的微孔条放回铝箔袋，放在装有干燥剂的自封口袋，仍然2～8℃保存；c. 将浓缩洗涤液按1：40的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；d. 根据AFP标准品、质控品及待测标本数确定所需孔数；e. AFP标准品、质控品直接取50μL加入相应孔内，用前摇匀；f. 在待测标本孔中先分别加45μL标本稀释液；g. 取5μL血清加入已加标本稀释液的孔内，用移液器吹打，孔内液体由绿色变为蓝色；h. 每孔加入50μL AFP酶结合物，用振荡器振荡30秒钟，盖上封板膜，置水浴箱37℃水浴1小时；i. 洗板：甩尽板中液体，用洗涤液注满各孔，停留10秒后用力甩去，重复5次后拍干；j. 加底物：根据使用量，将底物液A和底物液B按1：1充分混匀，每孔加入新配制的发光底物50μL，用振荡器振荡20秒，放入发光仪内，于10～20分钟内测量结果；β‑HCG测定：a. 将在冷藏环境中贮藏的试剂室温平衡；b. 从铝箔袋中取出所需的微孔板条插入框架内，将不用的微孔条放回铝箔袋，放在装有干燥剂的自封口袋，仍然2～8℃保存；c. 将浓缩洗涤液按1：40的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；d. 根据β‑HCG标准品、质控品及待测标本确定所需孔数；e. β‑HCG标准品、质控品混匀后直接取50μL加入相应孔内；f. 在待测标本孔中先分别加25μL标本稀释液；g. 取25μL血清加入已加标本稀释液的孔内，用移液器吹打几次，孔内液体由绿色变为蓝色；h. 用振荡器振荡30秒钟，盖上封板膜，置37℃水浴1小时；i. 洗板：甩尽板中液体，用洗涤液注满各孔，停留10秒后用力甩去，重复5次后拍干；j. 孔加入50μL β‑HCG酶结合物，37℃水浴15分钟，甩尽板中液体，用洗涤液注满各孔，停留10秒后用力甩去，重复5次后拍干；k. 加底物：根据使用量，将底物液A和底物液B按1：1充分混匀，每孔加入新配制的发光底物50μL，用振荡器振荡20秒钟，放入发光仪内，于10～20分钟内测量结果；（3）检测结果根据各标准溶液发光值，借助微孔板化学发光仪分析软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择X‑Y，得标准曲线；根据标准曲线即可计算出AFP、β‑HCG的浓度；将标本对应的孕妇年龄、孕周、体重输入配套的数据分析软件；将AFP、β‑HCG测定的浓度输入配套的数据分析软件；结合输入的浓度，通过数据分析软件，计算唐氏综合症或胎儿其他染色体异常的危险系数。