一种高通量快速筛选罗氏沼虾免疫增强剂的方法

摘要

本发明公开了一种高通量快速筛选罗氏沼虾免疫增强剂的方法。本发明包括待筛选免疫增强剂的处理、罗氏沼虾血淋巴细胞的采集与培养以及罗氏沼虾非特异性免疫指标的检测与分析三大步骤。本发明能够在体外快速、高通量的进行罗氏沼虾免疫增强剂的筛选。

主权项

一种高通量快速筛选罗氏沼虾免疫增强剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：一、待筛选免疫增强剂的处理将待筛选免疫增强剂与灭菌的PBS缓冲液混合，配制成浓度为0.5‑1.0mg/mL的待筛选免疫增强剂溶液，然后用滤膜过滤除菌，4℃保存待用；二、罗氏沼虾血淋巴细胞的采集与培养（1）选取健康的罗氏沼虾成虾，对罗氏沼虾成虾体表消毒；（2）在紫外消毒过的超净工作台或生物安全柜中，利用一次性注射器通过虾围心腔采集血淋巴，将采集的血淋巴快速注入已高压灭菌的抗凝剂中混合均匀，得到血淋巴与抗凝剂的混合液；（3）向血淋巴与抗凝剂的混合液中加入青链霉素，混匀后转入24孔或48孔细胞培养板中，每孔1‑2ml，静置30‑60min后用倒置显微镜观察细胞贴壁情况；（4）待细胞贴壁，去除上清液后，先向细胞培养板各孔中加入1‑2ml的L‑15或1640细胞培养液，然后加入不同种类的待筛选免疫增强剂溶液，每种待筛选免疫增强剂溶液分别加入50μL/孔、100μL/孔、150μL/孔三种体积作平行，轻轻震荡细胞培养板，混合均匀；（5）将细胞培养板密封后，置于恒温生化培养箱，28±1℃培养；三、罗氏沼虾非特异性免疫指标的检测与分析（6）在培养的不同时段采集细胞：先去除细胞培养液，再用PBS缓冲液进行漂洗，然后收集细胞于300‑500μL PBS缓冲液中，获得细胞悬液；（7）细胞悬液在冰浴条件下利用超声波细胞破碎仪破碎细胞；（8）采用BCA法蛋白定量试剂盒测定各组样品的总蛋白量；（9）然后分别测定各组样品的PO、POD、SOD、AKP、ACP和LZM值，计算后结合对照组进行比较分析，筛选样品PO、POD、SOD、AKP、ACP和LZM值中一种或几种值显著高于对照组的样品，得到罗氏沼虾免疫增强剂。