一种多氯联苯单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明公开了一种多氯联苯单克隆抗体的制备方法，首先采用多氯联苯半抗原化学合成完全抗原，然后将完全抗原作为免疫原，通过动物免疫方法制备得到多氯联苯单克隆抗体。其中半抗原合成完全抗原采用碳二亚胺法，动物免疫采用小剂量长周期免疫方案。本发明制备的多氯联苯单克隆抗体特异性强、亲和力好，抗体参数可控、工艺简单，利于放大生产、实用性强。此法制备的多氯联苯抗体效价达2×10⁷，所制备的抗体冻干后，-20℃超低温保存，其稳定性至少可保持12个月以上。

主权项

一种多氯联苯单克隆抗体的制备方法，其特征在于：首先采用多氯联苯半抗原化学合成完全抗原，然后将完全抗原作为免疫原，通过动物免疫方法制备得到多氯联苯单克隆抗体；其中半抗原合成完全抗原采用碳二亚胺法，包括以下步骤：     (1)首先配置浓度为1~3mg/100ul的半抗原TE buffer溶液、浓度为0.2~0.5mg/100ul的牛血清蛋白TE buffer溶液和浓度为20~40mg/100ul的碳二亚胺TE buffer溶液；(2)磁力搅拌下，将半抗原TE buffer溶液加入含牛血清蛋白TE buffer溶液中得到混合溶液，混合溶液边震荡边滴加碳二亚胺TE buffer溶液，半抗原与牛血清蛋白的反应质量配比为 1:0.1~1:0.5，半抗原与碳二亚胺的质量比为1：16，然后将装有三种溶液的容器放于摇床中于35‑37℃条件下震荡反应2~4 h，反应得到偶联物，即完全抗原；(3)用Sephadex柱将步骤(2)容器中反应得到的偶联物和未结合的半抗原小分子分离，然后将分离出来的偶联物溶液装入透析袋透析纯化，在pH为7. 2的0. 01 mol/L 磷酸盐缓冲液PBS中于4℃条件下透析3天，每天换液2次，去除游离小分子化合物，离心分出上清液得多氯联苯‑BSA，经紫外可见分光光度计扫描鉴定后，多氯联苯‑BSA偶联物分装后于‑ 20 ℃保存备用；所述动物免疫方法包括以下步骤：   (1)将多氯联苯‑BSA偶联物作为免疫原与等体积完全佐剂充分混匀，直至一小滴在水中不扩散充分乳化后，对Balb/c小鼠进行初次免疫注射，所用免疫原用量为50‑200ug/只；每隔一段时间后以等体积的不完全佐剂乳化纯化抗原进行追加强化免疫，每次免疫一周后取静脉血检测抗体效价，若抗体效价达到10^‑4~10^‑5，与追加强化免疫同样的方法进行加强免疫，加强免疫后第3天后按步骤（2）进行细胞融合；  （2）将免疫动物脾细胞与骨髓瘤细胞以10:1混合，用50%（w/v）聚乙二醇作融合剂将两种细胞融合，融合细胞悬于20%（w/v）小牛血清的2%（w/v）HAT选择性培养基内，将融合细胞接种于Balb/c小鼠腹腔渗出细胞作滋养层的96孔细胞培养板中，再将细胞培养板置于质量浓度为5%的CO₂培养箱中于37℃下生长；待生长达到1/4~1/3视野时，取上清液进行筛选；融合第6~8天，融合细胞开始形成集落，计算细胞融合率，并进行完全换液，完全换液3~5天后进行第一次ELISA筛选，以筛选到仅与多氯联苯‑OVA阳性反应，与BSA、OVA不反应的孔进行亚克隆；亚克隆7~10天后再进行单克隆孔的ELISA筛选，如此亚克隆3~5次，得到稳定分泌单抗的杂交瘤细胞；   （3）腹水的制备及抗体类及亚类的制备：选取20~22只雌性Balb/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降殖烷，7d后，腹腔注射第（2）步得到的杂交瘤细胞2×10⁶细胞/只，1~2周后待Balb/c小鼠腹部显著膨隆，处死Balb/c小鼠并取出腹水，以10000r/min离心30s，吸出上清液备用；进行抗体的免疫球蛋白及亚类鉴定，纯化抗体后，冻干保存即可；抗体纯化采用Protein A Sepharose 4B亲和层析法。