一种通过转化大豆毛状根鉴定抗蚜基因抗性功能的方法

摘要

本发明公开了一种通过转化大豆毛状根鉴定抗蚜基因抗性功能的方法，通过发根农杆菌侵染大豆成熟种子培养毛状根，以转基因的毛状根来验证抗蚜基因对大豆蚜虫的效果，涉及农作物组织培养及转基因方法领域。主要步骤包括：大豆成熟种子的子叶获得培养技术；发根农杆菌的侵染转化技术；转基因毛状根除菌及继续培养技术；转基因毛状根接蚜技术；转毛状根抗蚜功能基因的鉴定技术。该方法简单，易操作，不受季节限制，能有效、快速的通过转基因毛状根来鉴定目的基因对大豆蚜虫的抗性效果，也可为其他作物的抗性鉴定提供借鉴。

主权项

一种鉴定大豆抗蚜基因的方法，包括如下步骤： 1)获得大豆子叶； 2)侵染转化诱导毛状根； 3)除菌并继续培养； 4)毛状根接蚜； 5)抗蚜功能鉴定； 所述步骤1)中，所述大豆子叶为感蚜虫大豆种子萌发5～7天后形成的子叶； 所述步骤2)中，所述“侵染转化诱导毛状根”，是指采用携带有待鉴定基因的发根农杆菌侵染所述大豆子叶，并诱导毛状根长出； 所述步骤1)中，获得大豆子叶的方法为：挑选健康无病斑的成熟大豆籽粒，清水漂洗干净，体积分数75％酒精消毒30～60秒，质量体积分数0.1％的Ca(ClO)₂消毒20～30分钟，期间摇晃5～7次，无菌水洗去Ca(ClO)₂残留，冲洗5～8次，接种在萌发培养基中，进行萌发培养，无菌萌发5～7天后得所述大豆子叶；所述萌发培养，培养条件为，光照16h/天，25±3℃；萌发培养基的成分为，MSB+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值为5.8； 所述步骤2)中，发根农杆菌侵染转化诱导毛状根的方法为：将子叶从下胚轴切下，在子叶近胚轴处，远轴心面切一伤口，伤口深至中轴，但不穿破子叶，将切好的子叶放在内附滤纸的培养皿中，并滴加1/4MSB5液体培养基，使滤纸完全湿润但无剩余，在子叶的伤口处滴加20μL发根农杆菌菌液，封口膜封住培养皿，暗培养3～5天后恢复光照培养，光照16h/天，25±3℃，培养1～2周，产生毛状根；其中，诱导毛状根所用的携带抗性基因Rag1的菌株Rag1‑pHB‑K599的构建方法为：通过特异引物RT‑PCR扩增目的基因片段，转化大肠杆菌DH5α，经测序验证后提取质粒进行双酶切，将酶切目的基因片段连接到经相同酶切回收的载体pHB上，之后将重组质粒Rag1‑pHB转化农杆菌K599，在含有链霉素和卡那霉素的YEB平板上进行筛选和PCR验证，之后扩大培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，用于侵染转化诱导毛状根； 所述步骤3)中，除菌并继续培养的方法为：将毛状根切下，置于无菌培养皿中，用含噻孢霉素的无菌水冲洗3～5遍，除菌后继续培养；所述除菌后继续培养的培养基为1/4MSB5+Cef 500mg/L，继续培养时间为3～5天； 步骤4)中，毛状根接蚜的方法为：将大豆蚜虫接种到毛状根上，每个培养皿接蚜虫3‑5头；所述大豆蚜虫为在感蚜大豆品种的离体叶片上培养的均一化的3龄大豆蚜虫，所述大豆蚜虫的繁殖是在感蚜大豆品种的离体叶片上进行的； 所述步骤5)中，抗蚜功能鉴定的方法为：以大豆蚜虫的平均相对生长速率和平均相对繁殖速率作为待检基因抗蚜性鉴定的依据， 平均相对生长速率(g/d)＝[LN(最终蚜虫总重量)‑LN(起始蚜虫总重量)]/接蚜天数×100％ 平均相对繁殖速率(No./d)＝(最终蚜虫数量‑起始蚜虫数量)/接蚜天数。