一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌及其构建方法和蛋白表达

摘要

本发明涉及一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌及其构建方法和蛋白表达。利用大肠杆菌发酵生产类人胶原蛋白时，乙酸积累会影响菌体生长及蛋白表达，而现有减少乙酸副产物的方法会降低胶原蛋白产量。本发明以保藏编号为CGMCCNo.0743的大肠杆菌BL21为出发菌，采用Red同源重组，用安普霉素抗性基因替换大肠杆菌基因组上的ptsG基因，然后通过质粒pCP20表达的FLP内切酶消除安普霉素抗性基因，得到敲除ptsG基因的大肠杆菌工程菌CGMCCNo.7331。本发明通过基因工程手段改造大肠杆菌葡萄糖吸收途径，减少乙酸积累，提高类人胶原蛋白的积累，葡萄糖的消耗量减少9%-28%，类人胶原蛋白的产量可提高20%-30%。

主权项

一株高效表达类人胶原蛋白的ptsG基因敲除重组菌的构建及表达方法，其特征在于：由以下步骤实现：步骤一：构建重组菌：以保藏编号为CGMCC No.0743的大肠杆菌BL21为出发菌，采用Red同源重组，用安普霉素抗性基因替换大肠杆菌基因组上的ptsG基因，然后通过质粒pCP20表达的FLP内切酶消除安普霉素抗性基因，得到敲除ptsG基因的大肠杆菌工程菌；所述的重组菌于2013年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7331；步骤二：重组菌在发酵培养基、M9培养基或30L发酵罐中生产类人胶原蛋白：1）重组菌在发酵培养基中生产类人胶原蛋白：①将重组菌在LB固体平板上划线，34℃培养12h，转接于另一LB固体平板，34℃继续培养12h，得到活化的种子平板；②从种子平板上挑取单菌落，接种于含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，34℃培养12h，转接于含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，34℃培养6h，最后以1%‑8%接种量接种于终容量为50ml培养基的250ml三角瓶中，34℃，220rpm培养，发酵生产类人胶原蛋白，在发酵到6h时，将温度提高到42℃诱导类人胶原蛋白表达，诱导3h，发酵到9h时将温度调为39℃，使菌体继续生长并继续表达类人胶原蛋白，发酵到12h‑14h时发酵结束；步骤②中，所述培养基为专用发酵培养基，其配方为：葡萄糖 10‑15g/L，酵母粉 10‑12g/L，硫酸铵 5‑6g/L，磷酸氢二钾8‑9g/L，磷酸二氢钠4‑5g/L，EDTA 1.0‑1.5g/L，微量元素0.5‑1.5ml，硫酸镁 1‑2g/L，卡那霉素 0.0025‑0.0035g/L，余量为水；2）重组菌在M9培养基中生产类人胶原蛋白：①将重组菌在LB固体平板上划线，34℃培养12h，转接于另一LB固体平板，34℃继续培养12h，得到活化的种子平板；②从种子平板上挑取单菌落，接种于含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，34℃培养12h，转接于含50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，34℃培养6h，最后以1%‑8%接种量接种于终容量为50ml培养基的250ml三角瓶中，34℃，220rpm培养，发酵生产类人胶原蛋白，在发酵到6h时，将温度提高到42℃诱导类人胶原蛋白表达，诱导3h，发酵到9h时将温度调为39℃，使菌体继续生长并继续表达类人胶原蛋白，发酵到12h‑14h时发酵结束；步骤②中，所述培养基为M9培养基；3）重组菌在30L发酵罐中生产类人胶原蛋白：①将重组菌在LB固体平板上划线，34℃培养12h，转接于另一LB固体平板，34℃继续培养12h，得到活化的种子平板；②从种子平板上挑取单菌落，接种于2瓶含80ml LB液体培养基的300ml三角瓶中，34℃培养12h，转接于8瓶含80ml LB液体培养基的300ml三角瓶中，34℃培养10h，最后将640ml种子液接种于含16L灭过菌的发酵培养基的30L发酵罐中，溶解氧通过通入纯净的空气控制在25%饱和度，pH通过加入氨水控制在6.8，当底物培养基消耗光了之后开始通过补料方式补加新鲜的培养基，当菌体干重达到45 g DCW/L时，升温至42℃诱导类人胶原蛋白表达，维持3h，调节温度至39℃，使菌体继续生长并继续表达类人胶原蛋白；步骤②中，所述培养基为专用发酵培养基，其配方为：葡萄糖 10‑15g/L，酵母粉 10‑12g/L，硫酸铵 5‑6g/L，磷酸氢二钾8‑9g/L，磷酸二氢钠4‑5g/L，EDTA 1.0‑1.5g/L，微量元素0.5‑1.5ml，硫酸镁 1‑2g/L，卡那霉素 0.0025‑0.0035g/L，余量为水。