一种生物合成乙基香兰素的方法

摘要

本发明涉及一种生物合成乙基香兰素的方法。将含扁桃酸脱氢酶基因的菌株，pET30a-mdlB质粒的大肠杆菌BL21(DE3)接入发酵培养基，加入诱导剂，添加3-乙氧基-4-羟基苯乙醇酸，发酵得含3-乙氧基-4-羟基苯乙酮酸的发酵液；将含苯乙酮酸脱羧酶基因的菌株，保藏编号为ATCC12633的恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)或者铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)接种于上述发酵上清液，发酵得含有乙基香兰素的发酵液。本发明首次提出了用微生物发酵的方法合成乙基香兰素的途径，具有反应条件温和，环境污染小，操作简便等优点，提供了一种新的合成乙基香兰素的方法。

主权项

一种生物合成乙基香兰素的方法，其特征在于以3‑乙氧基‑4‑羟基苯乙醇酸为底物，具体包括如下步骤：(1)将含有扁桃酸脱氢酶基因的工程菌pET30a‑mdlB的大肠杆菌BL21(DE3)接种于琼脂斜面培养基，活化，活化条件为在37℃培养24h，将活化后的菌种转接于含卡那霉素的LB种子培养基培养12h；(2)以5％的接种量将种子培养液接种于含卡那霉素的LB发酵培养基，发酵，发酵条件为在37℃培养2h，加入IPTG，使其终浓度为0.2mM，30℃诱导6h；(3)离心收集发酵培养液中的菌体，除去上清液，用无菌水洗涤，悬浮于含0.5％的3‑乙氧基‑4‑羟基苯乙醇酸的磷酸盐缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液为Na₂HPO₄1.12％，NaH₂PO₄2.14％，MgSO₄0.01％，pH＝7，发酵，发酵条件为30℃，200rpm，发酵40h，即得含3‑乙氧基‑4‑羟基苯乙酮酸的溶液；将含有3‑乙氧基‑4‑羟基苯乙酮酸的发酵液离心，离心条件为以5000rpm离心25min，取上清液，调pH＝7，灭菌，待用；(4)将含有苯乙酮酸脱羧酶的恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)ATCC12633，经琼脂斜面培养基活化，转接于pH＝7的含KH₂PO₄2.0％、牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、NaCl0.5％的种子培养基中，在30℃培养8h；(5)将得到的种子培养液以50％的接种量接种于步骤(3)得到的含有3‑乙氧基‑4‑羟基苯乙酮酸的发酵上清液，发酵，发酵条件为在30℃，200rpm，发酵24h，得含乙基香兰素的发酵液。