白化病模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法

摘要

本发明涉及一种白化病模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法，该重构卵的构建方法通过敲除酪氨酸酶基因获得了白化小型猪的重构卵，且将CRISPR/Cas9基因敲除技术与体细胞核移植技术结合，证明该方法用于构建基因修饰猪的高效可行性。获得TYR基因敲除猪具有典型白化特征，可为人类白化疾病研究提供一种可靠的动物模型，且能应用于毒性及过敏反应的检测等多方面，有望成为类似白化小鼠的一种标准化实验动物。

主权项

一种白化病模型猪的重构卵的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：针对猪物种的酪氨酸酶基因的第一外显子的正链及互补链上满足G(N)₁₉NGG序列模式的序列部分分别设计gRNA的识别序列，分别记为第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列，其中，所述第一gRNA识别序列与所述第一外显子的正链上序列G(N)₁₉一致，所述第二gRNA识别序列与所述第一外显子的互补链上序列G(N)₁₉一致，N为A、T、C或G，下标19表示N的个数；步骤二：分别对所述第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列设计互补序列，以构建含有所述第一gRNA识别序列的第一双链DNA和含有第二gRNA识别序列的第二双链DNA；步骤三：分别根据所述第一双链DNA和所述第二双链DNA设计gRNA表达载体，记为第一gRNA载体和第二gRNA载体，其中，所述第一gRNA载体中含有所述第一双链DNA，所述第二gRNA载体中含有所述第二双链DNA；步骤四：将所述第一gRNA载体、所述第二gRNA载体及含有Cas9切口酶基因的表达载体转染进微型猪胎儿成纤维细胞中，筛选出酪氨酸酶基因敲除的阳性克隆细胞；步骤五：将所述阳性克隆细胞注入母猪的去核卵母细胞中，形成重构卵。