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一种提取烟粉虱内共生菌菌胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)收集烟粉虱成虫，短时浸于含70％乙醇中，静置，收集离心管底部虫体，然后用灭菌双蒸水反复漂洗；2)将消毒后的虫体置于解剖镜下，去除虫体头、胸、中肠组织，并收集剩余组织；3)将步骤2)收集的虫体组织置于PBS缓冲液中，匀浆并研磨成粗样；4)匀浆液分别在60、40、20微米孔径微型过滤器中过滤，收集过滤液，去掉过滤器中的虫体碎片；5)滤液用NaCl稀释成样品，在梯度液Percoll比重1.146‑1.083g/ml范围内进行非连续密度梯度离心，Percoll浓度依次为20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％，离心1小时，进行梯度介质筛选,其中,当Percoll浓度为20‑35％时，离心力为5千克力；当Percoll浓度为30‑45％时，离心力为5千克力；当Percoll浓度为40‑60％时，离心力为4千克力；当Percoll浓度为50‑75％时，离心力为4千克力；当Percoll浓度为60‑80％时，离心力为4千克力；6)首次离心4000g，离心1小时，然后逐层去除Percoll液，分离获得初次离心的菌胞粗提液，收集不同界面部位的细胞；7)将菌胞粗提液分别加入下一级梯度继续离心，重复步骤6)操作，获得含有Percoll液的菌胞；如果分离层面效果不好，继续重复步骤7)，直至层面稳定、单一；8)收集的菌胞在4℃，3,000g条件下离心1小时，回收离心管底部沉淀物，用PBS缓冲液稀释，离心洗涤以去除过多的梯度介质，获得富含菌胞的沉淀物。 |
