一种猪白细胞介素12两个亚基基因p35和p40拼接的新方法

摘要

本发明公开了一种猪白细胞介素12两个亚基基因p35和p40拼接的新方法，采用的连接肽基因序列来源于牛弹性蛋白基序，从中选择常用的限制性内切酶Kpn I。p40引物的下游5′末端含有连接肽基因并具有Kpn I酶切位点，而p35引物的上游5′末端含有连接肽基因并具有Kpn I酶切位点。这样p35、p40两个亚基基因PCR产物经Kpn I酶切后产生互补的黏性末端，在DNA连接酶的作用下，p35、p40两个亚基基因通过连接肽基因易连接。连接产物通过p40上游引物与p35下游引物进行PCR得以扩增。本发明是是一种简单、方便有效的利用连接肽基因将两个亚基基因相连的分子克隆方法。

主权项

一种猪白细胞介素12两个亚基基因p35和p40拼接的新方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)p40和p35基因片段的获得根据GenBank上的p40、p35基因序列，设计引物由上海生工公司合成，p40引物：上游引物：5′‑AAA TA TGCGGCCGCTAA GCCACCA T‑GGGTCAC‑3′，在5′端引入N ot I酶切位点，下游引物：5′‑GGCAGGTACCCCTACTCCA GGAAC‑CATTCGCTCCAA GA TGA GCT‑3′，在5′引入Kp n I酶切位点；p35引物：上游引物：5′‑A TC2CGGTACCTGGGGTGGGCGCCA GAAACCTCC‑CCGTGGCCA‑3′，5′端引入Kp n I酶切位点，下游引物：5′‑CCGCTCGA GCGTTA GGAA GCA T‑TCA GA TA G‑3′，5′端引入X ho I酶切位点，在p40下游引物和p35下游引物引入两个亚基基因连接的连接肽基因，为GTTCCTGGA GTA GGGG‑TACCTGGGGTGGGC，内部含有Kp n I酶切位点，分别以质粒p ED(EMC‑3)‑p40、p ED(EMC‑3)‑p35为模板，应用Taq DNA聚合酶及上述引物扩增p40、p35基因片段，p40基因片段PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环，末次循环后72℃延伸10min，p35基因片段PCR反应条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环，末次循环后72℃延伸10min，PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳予以鉴定；(2)p40和p35基因片段拼接PCR产物利用凝胶回收试剂盒按说明回收纯化，用Kpn I酶切纯化的p40、p35基因PCR产物，酶切片段用凝胶回收试剂盒按说明回收纯化，应用T4DNA连接酶对纯化的酶切片段进行连接，以连接产物为模板，应用Taq DNA聚合酶、p40上游引物和p35下游引物进行连接产物的PCR扩增，PCR反应条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min30s，共30个循环，末次循环后72℃延伸10min，PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳予以鉴定；(3)p40、p35基因片段拼接产物的克隆与鉴定连接产物的PCR产物利用凝胶回收试剂盒按说明回收纯化，得到的目的拼接片段应用Kpn I酶切鉴定，目的拼接片段与pMD18‑Tvector进行连接，并转化大肠杆菌JM109，经37℃培养24h，蓝白筛选，随机挑取白色菌落，扩菌后应用质粒小量快速提取试剂盒按说明提取质粒，以N ot I和Xho I双酶切，37℃水浴2h，通过1％琼脂糖凝胶电泳予以鉴定，酶切鉴定正确后再送交上海生工测序中心进行测序鉴定。