基于荧光偏振的ERCC1基因第ll8位密码子单核苷酸多态性均相检测法

摘要

本发明涉及一种基于荧光偏振的ERCC1基因第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性的均相检测方法。本发明克服了现有技术存在的成本高、操作步骤繁琐、易发生污染和影响检测结果准确性问题，本方法步骤简单，操作简单；闭管中一步完成，不易污染。成本低，不需任何专用试剂及荧光淬灭或微沟槽结合剂。通过应用单端标记的ERCC1基因第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性特异的探针，导致荧光偏振值的改变，检测ERCC1基因第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性，检测结果更客观准确。结果分析简单，结果判断时仅需数字比较，易标准化、自动化，应用范围广，可用于检测临床血液或组织标本。

主权项

一种用于测定样品中ERCC1基因第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性的均相检测法，所述均相检测法包括下列步骤：（1）从样品中得到提取物：使用一种试剂或试剂盒从待测样品中提取基因组DNA，并纯化，得到纯化的提取物； （2）扩增反应：将上述纯化的提取物加入反应试剂进行扩增结合，所述反应试剂包括10倍的PCR缓冲液,浓度各为 2.0～2.5mmol/L的dNTP，2.0～3.5mmol/L的MgCl₂，1‑5U/μl的TaqDNA聚合酶，浓度为0.2‑2.0μmol/L的ERCC1基因第4个外显子涵盖第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性区DNA的通用引物，以及浓度为0.05‑0.2μmol/L的ERCC1基因Codon118 C/T单核苷酸多态性的带荧光标记的DNA探针，所述反应条件是：94‑96℃变性4‑10min后，95℃孵育5‑40秒，53‑63℃孵育15‑60秒，72℃孵育10‑60秒，35‑45个循环，最后室温孵育；（3）检测：检测反应溶液的荧光偏振FP值，SPSS软件计算FP均值和标准差，t检验统计阴、阳性对照反应终液FP值分布:最低检测下限阳性对照反应终液FP均值+FP标准差<阴性对照反应终液FP均值‑FP标准差，阳性临界值Cut‑off=最低检测下限阳性对照反应终液FP均值，阴性临界值Cut‑off=最低检测下限阳性对照反应终液FP均值+FP标准差，待测样品FP值与Cut‑off值比较即知ERCC1基因Codon118单核苷酸多态性：待测样品FP值>阴性临界值 Cut‑off值，靶位点与反应中所加入相应荧光标记的探针序列非同源，待测样品FP值＜阳性临界值Cut‑off值，靶位点与反应中所加入相应荧光标记的探针序列同源,待测样品FP值>阳性临界值Cut‑off值，但同时待测样品FP值＜阴性临界值Cut‑off，则靶位点状态无法判断，需重新检测；其中，ERCC1基因第4个外显子涵盖第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性区DNA的通用引物为：正向引物5'‑cagtccagaacactgggacatgac‑3'，反向引物5'‑ggtcatccctattgatggcttctg‑3', Codon118 C/C基因型探针序列为5'‑ccaaattcccagggcacgttgcgcacg‑3'，或5'‑caaattcccagggcacgttgcgcacg‑3'，或5'‑caaattcccagggcacgttgcgcac‑3'，或5'‑caaattcccagggcacgttgcgc‑3'，或5'‑caaattcccagggcacgttgcg‑3'，或5'‑caaattcccagggcacgttgc‑3',Codon118 T/T基因型探针序列为5'‑ccaaattcccagggcacAttgcgcacg‑3'，或5'‑caaattcccagggcacAttgcgcacg‑3'，或5'‑caaattcccagggcacAttgcgcac‑3'，或5'‑caaattcccagggcacAttgcgc‑3'，或5'‑caaattcccag ggcacAttgcg‑3'，或5'‑caaattcccagggcacAttgc‑3'；本方法不用于疾病诊断目的。