鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法

摘要

本发明公开了一种鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法，鲶鱼抗菌肽突变体的氨基酸序列为KGRGKQGGKVRKSS，鲶鱼抗菌肽突变体的制备方法包括取料、反应、纯化、质谱分析鉴定等步骤。本发明鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法具有较高抗菌活性且安全无毒。

主权项

一种鲶鱼抗菌肽突变体的制备方法，其特征在于，鲶鱼抗菌肽突变体的氨基酸序列为KGRGKQGGKVRKSS，所述鲶鱼抗菌肽突变体的制备方法包括以下步骤：S1、将存放于冰箱中的原料试剂取出，置于干燥器中复温待用；S2、精确称量Fmoc‑AA‑Resin 0.1mmol后，置于合成反应器中，用DMF冲洗六次，然后加入2～3倍Fmoc‑AA‑Resin体积的DMF浸泡30分钟，通入氮气使Fmoc‑AA‑Resin能在溶液中上下翻动；S3、加入2倍Fmoc‑AA‑Resin体积的20％哌啶于合成反应器中，通入氮气反应10分钟，然后用DMF冲洗两次；S4、再次加入2倍Resin体积的20％哌啶于合成反应器中，通入氮气反应20分钟，然后用DMF冲洗六次；S5、称量0.45mmol的Fmoc‑AA、HOBt和HBTU，先用1ml DMF溶解HOBT及HBTU，后将溶液加入Fmoc‑AA中，活化15分钟；S6、将活化好的Fmoc‑AA溶液以及1mL DIEPA同时加入Fmoc‑AA‑Resin中；S7、调节氮气的流量，使Fmoc‑AA‑Resin能在溶液中上下翻动，使反应更完全，反应时间一般为2小时；S8、反应结束后用DMF、DCM、DMF依次各洗Fmoc‑AA‑Resin两次；S9、重复步骤S3至步骤S8，直到多肽序列偶联完为止；S10、加入2倍Fmoc‑AA‑Resin体积的20％哌啶反应，连续操作两次，反应时间分别为10分钟和20分钟，分别用DCM、DMF、DCM依次各洗Resin两次，最后一次洗完后，将Fmoc‑AA‑Resin尽量抽干，得肽树脂；S11、配制裂解液：1g肽树脂对应10ml裂解液；S12、将裂解液加入到合成反应器中，通入氮气反应2小时，期间需不时补充裂解液以防蒸干，另将无水乙醚置于‑20℃冰箱中冷冻备用；S13、反应完成后，将裂解液收集到预先称重的50ml离心管中，再用TFA清洗合成反应器2‑3次，洗液同样收集到50ml离心管中；S14、将冰箱中的无水乙醚取出，选择容器将乙醚倒入其中，按无水乙醚：裂解液＝10：1的体积比例将裂解液滴入冰冻的无水乙醚中，控制速度，尽量使滤液逐滴滴入，同时不断搅拌至不再产生沉淀为止；S15、将沉淀混合物静置数分钟后离心，弃上清，然后用新鲜的冰冻无水乙醚洗涤沉淀至少三次；S16、将所得沉淀物风干，之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥并称重，得到粗肽；S17、NH₄HCO₃自然氧化法氧化粗肽：配置0.1M NH₄HCO₃(pH8.2)溶液，按多肽终浓度0.3mg/ml的比例加入NH₄HCO₃溶液至粗肽中，室温搅拌过夜；之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥，称重备用；S18、将氧化后的粗肽进行纯化并质谱分析鉴定，得到鲶鱼抗菌肽Parasin I突变体；S19、将纯化并经质谱分析鉴定合格的鲶鱼抗菌肽Parasin I突变体用冻干机冷冻真空干燥，称重备用。