发明名称 |
草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法 |
摘要 |
本发明公开了一种草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法,包括以下步骤:1)蛋白质的提取;2)第一向IPG等电聚焦电泳;3)胶条的平衡;4)胶条的转移及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;5)凝胶扫描和图像分析。发明人在发明过程中考虑到草莓叶片富含多糖多酚类物质的特性,利用丙酮对草莓叶片蛋白进行多次沉淀抽提,改进了裂解液配方,提高了离心速率和粗蛋白沉淀的清洗次数和裂解液中尿素的浓度,从而建立了一套适合草莓叶片的差异双向电泳蛋白质组学方法,从而获得了高质量的草莓蛋白质差异图谱。运用本发明的方法能获得蛋白质点清晰、数目较多、分布均匀、背景清楚的草莓叶片蛋白质的双向电泳凝胶图谱。 |
申请公布号 |
CN103267791B |
申请公布日期 |
2014.12.31 |
申请号 |
CN201310202784.1 |
申请日期 |
2013.05.25 |
申请人 |
杭州市农业科学研究院 |
发明人 |
方献平;马华升;余红;阮松林;王淑珍;忻雅;童建新;肖文斐;来文国;裘劼人;郑桂珍;刘辉 |
分类号 |
G01N27/447(2006.01)I;G01N1/28(2006.01)I |
主分类号 |
G01N27/447(2006.01)I |
代理机构 |
杭州中成专利事务所有限公司 33212 |
代理人 |
金祺 |
主权项 |
草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法,其特征是包括以下步骤:1)、蛋白质的提取,包括以下步骤:①、取1g草莓叶片加入液氮,研磨后悬浮于14~16ml的三氯乙酸‑丙酮溶液中,于‑18~‑22℃沉淀10~14小时;所述三氯乙酸‑丙酮溶液中三氯乙酸的体积浓度为10%;②、将步骤①的所得物离心,弃上清;③、步骤②所得沉淀悬浮于14~16ml的B‑巯基乙醇冷丙酮溶液;离心,将所得的沉淀重复上述悬浮和离心2~5次;所述B‑巯基乙醇冷丙酮溶液的制备方法为:将冷丙酮与B‑巯基乙醇按照1:0.07%的体积比进行混合;所述冷丙酮为温度为3~5℃的丙酮;④、将步骤③所得的沉淀干燥处理,得到粗蛋白干粉;加入0.9~1.1ml裂解液A以溶解上述粗蛋白干粉,离心,所得上清为蛋白提取液;所述裂解液A为在每ml水中加入420mg尿素、150mg硫脲、40mg 3‑[3‑(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、7.2mg二硫苏糖醇、12μL载体两性电解质和5μL苯甲基磺酰氟混合后而得;2)、第一向IPG等电聚焦电泳:将50μL步骤1)所得的蛋白提取液和250μL IPG buffer混匀配成水化溶液,装入17cm等电聚焦槽中;取17cm的pH3‑10的等电聚焦胶条一根放入等电聚焦槽中,从而使等电聚焦胶条在水化溶液中均匀浸湿;再滴矿物油至等电聚焦槽的槽深1/2处,从而盖住整个等电聚焦胶条,盖上等电聚焦槽的槽盖后进行等电聚焦;等电聚焦操作按照仪器使用说明书进行;IEF设定参数如下:<img file="FDA0000589049830000011.GIF" wi="971" he="461" />上述IPG buffer的制备方法为:在每ml水中加入480mg尿素、20mg 3‑[3‑(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、7.5mg二硫苏糖醇和12μL载体两性电解质混合后而得;3)、胶条的平衡;4)、胶条的转移及SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳;5)、凝胶扫描和图像分析。 |
地址 |
310024 浙江省杭州市西湖区转塘杭新路东1号 |