一种测定草坪草内源激素的方法

摘要

本发明涉及一种测定草坪草内源激素的方法，包括以下步骤：1）将草坪草用磷酸钠缓冲液和二氯甲烷进行两次提取，两次离心后，然后氮气吹干，得到草坪草内源激素；2）将步骤1）得到的草坪草内源激素用甲醇溶解后，利用固相萃取柱进行脱色脱脂，取洗脱液，然后真空抽干后，再用甲醇和乙酸的混合溶液溶解；3）以甲醇和乙酸作为流动相，利用高效液相色谱对经过步骤2）处理后的草坪草内源激素进行测定，得到草坪草内源激素的含量。本发明的方法选择适宜的内源激素提取方法和色谱条件，准确测定草坪草内源激素的含量，与现有技术进行相比，具有回收率、提取效率高；准确率高、重复性好的优点。

主权项

一种测定草坪草内源激素的方法，包括以下步骤：先配置0.05M，pH＝7.0磷酸钠缓冲液，然后再用磷酸缓冲液溶解二乙基二硫代氨基甲酸钠，具体为100mL磷酸钠缓冲液溶解0.02～0.05g二乙基二硫代氨基甲酸钠；C₁₈固相萃取小柱为CNWBOND LC‑C18SPE小柱，500mg/3mL；(1)选取草地早熟禾和黑麦草，分开提取和检测，剪取0.3g新鲜叶片，加液氮研磨至粉碎；(2)加3mL 0.05M，pH＝7.0，含0.02％二乙基二硫代氨基甲酸钠的磷酸钠缓冲液，保持叶片重g：提取液体积mL＝1:10，转移到10mL的离心管中，在4℃下震荡1h后，用1M盐酸调pH至2.6，再加入3mL二氯甲烷，在4℃震荡1h；(3)取出离心管，将上个步骤得到的提取物在10000rpm下离心10min，取下清液约3mL转移至另一离心管中；残渣再加入3mL二氯甲烷，在4℃下继续震荡1h，10000rpm下离心10min，合并下清液；(4)用氮气吹干二氯甲烷，然后用1mL浓度80％甲醇溶解，涡旋5min后，利用C₁₈固相萃取小柱进行脱色脱脂：先用5mL甲醇活化C₁₈固相萃取小柱，再用5mL浓度80％甲醇平衡；然后再上草坪草内源激素待测样品，最后用1mL浓度80％甲醇洗脱，共收集2mL洗脱液，35℃真空抽干；(5)用400μL甲醇/0.075％乙酸溶液，V/V＝1:1的混合溶液溶解；涡旋3min；然后过0.45μm滤膜，转移至色谱瓶中；(6)利用安捷伦1260高效液相色谱仪对脱色脱脂后的草坪草内源激素样品进行测定，其色谱条件为：色谱柱为Agilent C₁₈反相柱5μm,4.6mm×25cm；流动相为甲醇∶0.075％的乙酸；流速为1mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；检测波长：ABA为262nm，IAA为280nm；以标样出峰时间和峰高叠加定性，外标法峰面积定量，梯度洗脱条件：标准曲线的制备：取适量母液，用甲醇：0.075％的冰乙酸＝1:1作为溶剂，配制成浓度梯度为：0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1.6μg/mL、3.2μg/mL的标样系列溶液，然后进行HPLC测定，获得标准曲线，从而建立起激素浓度和峰面积大小之间的函数关系；激素标样标准曲线方程分别为：Y_IAA＝0.0498X+0.0215，R2＝0.9998；Y_ABA＝0.0138X‑0.0026，R2＝0.9998；其中X为HPLC图谱上的峰面积；Y为样品激素浓度μg/mL；回收率的测定：采用添加标样法测定回收率：取同一盆草坪草叶片样品3份，在研磨时第1份不加激素标样；第2份加入IAA和ABA标样；第3份在步骤(5)中加入IAA和ABA标样，使其标样激素含量与第2份的理论含量相等，按提取步骤平行操作，并在相同的色谱条件下分别进样，三份样品的色谱图均出现与标样相同保留时间的激素吸收峰；有标样的样品上HPLC仪后，在这些激素的保留时间处色谱峰高和峰面积均增大，说明样品内源激素和添加的激素标样叠加出峰，回收率＝(第3份的峰面积‑第1份的峰面积)/(第2份的峰面积‑第1份的峰面积)*100％，重复5次，所得结果为：IAA的平均回收率为95％，ABA的平均回收率为90％。