可同时鉴别猪繁殖与呼吸综合症病毒的RT-PCR技术

摘要

本发明属于重大动物疫病检疫检测领域，具体涉及到一组用于可同时区别猪繁殖与呼吸综合症野毒株（包括经典毒株、高致病性毒株）和疫苗毒株鉴别诊断的RT-PCR引物、操作方法及其临床应用；设计特异性引物、提取RNA、利用RT-PCR两步法得到产物、将产物进行凝胶电泳，于凝胶成像系统进行观察；本发明把疫苗毒株序列存在双缺失区域（TJM-F92），作为野毒株和疫苗株分子诊断的靶区域，选择最优保守区域设计RT-PCR引物。该引物特异性好，对PRRSV疫苗株和野毒株(高致病性和经典毒株)可以鉴别诊断，且对其他猪源性病毒均无扩增反应。该方法检测极限为3.5TCID₅₀的PRRSV，对仪器要求不高，适用于基层检疫。

主权项

可同时鉴别猪繁殖与呼吸综合症病毒的RT‑PCR技术，其特征在于，步骤为：1）用于区分检测猪繁殖与呼吸综合症病毒野毒株与疫苗株的RT‑PCR引物包括正义引物和反义引物，分别为： 名称序列（5’‑3’）正义引物CGACACCATCCGAGCCG反义引物CCTGCACCTGTGTCATCAAGC 2）提取RNA ：   用DEPC(0.1%)H₂O溶解疫苗毒株干粉，取200µl疫苗，使用RNAiso plus提取RNA，用20µl无RNA酶的DEPC(0.1%)H₂O溶解RNA；3）RT‑PCR两步法：   以上一步骤提取的RNA为模板，配制10µl反转录体系进行反转录，10µl反应体系的配制：Random primer终浓度为2µM，20µM Random primer 1µl、10µM dNTPs 0.5µl、5x M‑MLV buffer 2µl、RNase Inhibitor (40U/µl) 0.5µl、 RTase M‑MLV (RNase H‑) 0.5µl、RNA模板5µl、RNase‑free H₂O 0.5µL；反转录程序为：30℃ 10 min、42℃ 60min、70℃ 15min、4℃ 5min，得到反转录产物；配制PCR混合体系：20µM正义引物和反义引物各0.5µl，2.5µM dNTPs 8µl,10xPCR buffer（Mg²⁺) 5µl，TAKARA Taq(5U/µl) 0.5µl，反转录产物2µl，用灭菌去离子水补充至25µl，PCR反应程序：95 ℃ 5min，以94 ℃ 30s、55 ℃ 30s 和72 ℃ 1min进行30个循环，72 ℃ 10min，4 ℃ 5min，得到产物；4）电泳观察：取10µl 的上述产物，经3%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察。