一种牛肉中三种主要致病菌多重PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种牛肉中三种主要致病菌多重PCR检测方法，该方法包括：沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7的菌株培养；不同增菌液对三种致病菌的增菌效果对比；选择引物；多重PCR扩增体系；提取待测牛肉样品中细菌的DNA；建立多重PCR反应体系参数。本发明的三种主要致病菌多重PCR检测方法，不仅保留了常规PCR的高特异性、敏感性，又减少了操作步骤，实现了一次扩增可同时检测多种微生物的目的，大大节省了时间，节约了经费开支。

主权项

一种牛肉中三种主要致病菌多重PCR检测方法，其特征在于，所述的牛肉中三种主要致病菌多重PCR检测方法包括：步骤一、菌株培养：无菌条件下用接种环分别挑取沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157：H7接种于TSB中，37℃震荡培养18h，沙门氏菌采用HE琼脂平板计数，单增李斯特菌采用PALCAM琼脂平板计数，大肠杆菌O157：H7采用麦康凯琼脂平板计数；步骤二、不同增菌液对三种致病菌的增菌效果对比：取经国标检测不含有沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157：H7的牛肉25g，分别加入到225mL的LB和TSB增菌培养基中，接种三种致病菌经平板计数使浓度均达到10⁰、10¹、10²、10³CFU/g，37℃振荡培养18h，分别提取细菌基因组DNA进行多重PCR，确定增菌液的增菌效果；步骤三、选择引物：通过BLAST与GenBank中的核苷酸序列比对，选出最佳的引物组合用于实验研究，选用广泛存在于沙门菌属的侵袭蛋白基因invA作为检测沙门菌属的特异性基因，选用hlyA基因作为单增李斯特菌的毒力标志基因，采用高度保守的O抗原基因rfbE和鞭毛抗原基因flic的引物来检测大肠杆菌O157：H7；步骤四、多重PCR扩增体系：所述多重PCR扩增中，25μL反应体系具体为：检测沙门氏菌的引物终浓度为0.2μmol/L，检测单增李斯特菌引物终浓度为0.1μmol/L，检测大肠杆菌O157：H7引物终浓度为1μmol/L flic和0.3μmol/L rfbE，Mg²⁺浓度为4mmol/L，dNTP浓度为0.4mmol/L，Taq DNA聚合酶0.5U，待检样品模板基因组为1μL，剩下的用无菌水补至25μL；步骤五、提取待测牛肉样品中细菌的DNA：取1mL培养18‑24h的菌液，进行细菌基因组DNA的提取和纯化，作为多重PCR扩增的模板；步骤六、建立多重PCR反应体系参数：多重PCR反应具体参数条件如下：95℃预变性30s，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。