淡紫醌霉素及其甲酯的制备方法

摘要

本发明公开了一种淡紫醌霉素及其甲酯的制备方法。以链黑菌素产生菌-柔毛链霉菌Streptomyces.flocculus CGMCC4.1223作为出发菌株，对该链黑菌素生物合成基因簇中的双氧化酶基因stnBl实行选择性敲除，获得相应的stnBl基因失活突变株ΔstnBl；对突变株发酵产物粗提物采用反相硅胶、凝胶等柱层析和半制备HPLC等色谱分析技术，制得淡紫醌霉素及其甲酯。本发明建立了利用链黑菌素产生菌通过基因工程手段制备淡紫醌霉素的方法，提高了淡紫醌霉素和淡紫醌霉素甲酯的产量，分别达到每5升培养基可以获得约1mg淡紫醌霉素和20mg淡紫醌霉素甲酯，并且经过菌种优化和发酵优化还有进一步提升的空间。

主权项

一种淡紫醌霉素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：A、以链黑菌素原始产生菌柔毛链霉菌Streptomyces flocculus CGMCC 4.1223为出发菌株，克隆得到链黑菌素生物合成基因簇；B、对所述链黑菌素生物合成基因簇中的双氧化酶stnB1基因进行选择性失活，获得stnB1基因失活突变菌株ΔstnB1；所述选择性失活包括如下步骤：设计一对stnB1基因的敲除引物如下：sftarstnB1‑For:5′‑GTGGACCGCGATATTTACACCAGCGAGAAGATCTTCGCGCTGGAGattccggggatccgtcgacc‑3′sftarstnB1‑Rev:5′‑GTCCCGCACGTCGGCTCCCTCGCCGCCCCGGCCGGGCGCGACCCCtgtaggctggagctgcttc‑3′；C、对所述突变菌株ΔstnB1进行发酵，将发酵液离心，离心后的滤液调整pH值至9～10，用不溶于水的中等极性有机溶剂A反复萃取，取水相滤液；D、调整所述水相滤液pH值至4～5，用所述不溶于水的中等极性有机溶剂A反复萃取，收集中等极性有机溶剂相B，浓缩得到粗提物B，对所述粗提物B进行纯化，即得；所述不溶于水的中等极性有机溶剂A为乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇。