一种猪脑心肌炎病毒HB10株感染性克隆质粒

摘要

本发明提供了一种猪脑心肌炎病毒HB10株感染性克隆质粒及其构建方法与应用，提供人工合成5′UTR和3′UTR序列并在中间加入多克隆位点(MCS)的方法，得到中间质粒pOK12-EMCV-5′UTR-MCS-3′UTR。本发明在合成EMCV5′UTR时，将polyC的碱基设定为15个。本发明利用设计的特异引物和特定的PCR反应条件，快速扩增EMCV基因组F1片段(6699bp)，并成功地连接到pOK12-5′UTR-MCS-3′UTR质粒，得到pOK12-rEMCV-H10B质粒，该cDNA感染性克隆质粒命名为pOK12-rEMCV-H10B。利用该质粒成功拯救出病毒-rEMCV-HB10，该拯救毒与母本病毒相比毒力减弱。利用EMCV-HB10的cDNA感染性克隆可以研究EMCV病毒致弱机理及开发EMCV低毒力的减毒疫苗。利用该病毒的cDNA感染性克隆为载体插入不同病毒保护性抗原基因，构建不同嵌合病毒，以及由此开发出双价或多价疫苗及其他可能的应用。

主权项

一种猪脑心肌炎病毒HB10株cDNA感染性克隆质粒及其构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据EMCVHB10基因序列设计特异性的PCR引物：EMCV‑F1‑F：GACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTC(含Hind III酶切位点)EMCV‑F1‑R：TTAGCATTGAGGTCGCTGCACAAC(含Afe I酶切位点)；(2)将合成的EMCV5′UTR‑MCS‑3′UTR片段用EcoR I、BamH I从pGH‑EMCV5′UTR‑MCS‑3′UTRR质粒上酶切，回收纯化产物与pOK12载体进行连接，得到质粒pOK12‑EMCV‑5′UTR‑MCS‑3′UTR；(3)用特异引物EMCV‑F1‑F、EMCV‑F1‑R对EMCV基因的cDNA进行扩增，得到EMCV基因组的F1片段，用HindIII、AfeI双酶切F1片段和质粒pOK12‑EMCV‑5′UTR‑MCS‑3′UTR，回收、连接，得到全长pOK12‑rEMCV‑HB10克隆质粒。