一种选择性扩增孕妇血浆中游离胎儿DNA的方法

摘要

本发明涉及一种选择性扩增游离胎儿DNA的方法，包括如下步骤：将孕妇血浆中游离DNA末端补平后经加A反应，得到有粘性末端的游离DNA后与利用寡核苷酸制备的接头DNA进行连接反应，以连接产物为模板，寡核苷酸为引物进行PCR扩增反应：72℃接头延伸，80-87℃预变性3min，80-87℃变性20s，72℃退火20s，72℃延伸，80-87℃变性20s，57℃退火20s，72℃延伸，4℃保温。本方法选择性扩增游离胎儿DNA而不扩增母体游离DNA，可最大程度消除母体DNA背景干扰，提高游离胎儿DNA浓度，从而提高诊断的灵敏度与特异性。

主权项

一种选择性扩增孕妇血浆中游离胎儿DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)合成两条寡核苷酸，寡核苷酸甲3’端为T碱基，从寡核苷酸甲3’端的第二个碱基与寡核苷酸乙5’端开始互补；将寡核苷酸乙5’端用磷酸根修饰；经退火反应得到接头DNA；(2)将游离DNA末端补平后经加A反应，得到有A粘性末端的游离DNA；(3)将步骤(1)得到的接头DNA和步骤(2)得到的有A粘性末端的游离DNA进行连接反应，得到连接产物；(4)利用步骤(3)所述的连接产物为模板，步骤(1)中的寡核苷酸甲为引物进行PCR扩增，反应过程如下：(a)72℃下接头延伸5min，(b)80～87℃下预变性3min，(c)80～87℃下变性20s，(d)72℃下退火(每个循环较前一循环降低0.5℃)20s，(e)72℃下延伸2min，(f)重复(c)‑(e)30个循环，(g)80～87℃下变性20s，(h)57℃下退火20s，(i)72℃下延伸2min，(j)重复(g)‑(i)10‑20个循环，(k)72℃下延伸5min，(l)4℃下保温。