花*精子超低温冷冻保存和复苏方法

摘要

本发明公开了一种花精子超低温冷冻保存和复苏方法，具体为选择形态正常、生长良好、健康无疾病、达到性成熟的亲本，对其进行激素诱导，促使精子成熟，采精，稀释，添加抗冻剂，液氮冷冻保存后，解冻，进行人工授精。本发明具有操作时间短、成本低、操作方便、保存时间长、损伤程度小、复苏后精子成活率较高等优点，在花的种质保存、遗传育种、可持续养殖及病害防治等方面有着重要的理论意义和应用价值。

主权项

一种花精子超低温冷冻保存和复苏方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)亲本选择：选择形态正常、生长良好、健康无疾病、达到性成熟的花雄鱼作为亲本，(2)取精：对性成熟的雄鱼注射催产剂，在水温16‑18℃环境中暂养16‑20h后，轻压鱼腹，取精液； (3)冷冻：将精液与稀释液按1:2‑3的体积比混合均匀，2‑4℃下平衡20‑30min后，加入抗冻剂DMSO混匀得混合精液，分装至离心管中，置于液氮液面上方4‑7cm处平衡15‑20min，然后再置于液氮液面上平衡5‑8min，再放入液氮中保存； (4)复苏：从液氮中取出装有精液的离心管，置于液氮蒸汽中平衡5‑10min，然后迅速置于37±1℃水浴中快速晃动至融化得解冻精液； (5)人工授精：将解冻精液与花鱼卵混合进行人工授精；所述催产剂由绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素A₂和马来酸地欧酮组成，每千克体重的鱼催产剂注射量为：绒毛膜促性腺激素500‑750IU，促黄体素释放激素A₂ 4‑6微克，马来酸地欧酮2‑3毫克；所述稀释液的配方为：氯化纳1.0‑1.5wt％、氯化钾0.05‑0.1wt％、葡萄糖1‑2wt％，余量为水；所述混合精液中抗冻剂DMSO占的体积百分比为6‑8％；人工授精是将解冻精液与花鱼卵搅拌混匀后，加入泥浆水中，继续搅拌10‑60秒，再用清水清洗鱼卵，洗净后放入孵化器中孵化；解冻精液与花鱼卵用量为每300ml鱼卵加10‑15ml解冻精液；泥浆水的体积为花鱼卵体积的3‑5倍。