一种猪肉中主要致病菌五重PCR快速检测方法

摘要

本发明公开了一种猪肉中5种主要致病菌五重PCR快速检测方法。该方法是先提取待测肉样中总细菌DNA，然后合成SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.12所示引物；进行五重PCR反应，PCR产物用2%琼脂糖进行电泳分析，根据电泳结果进行判断。用本发明方法检测猪肉中种食源性致病菌(沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌和大肠杆菌O157:H7)的最低检测限分别为142、51、9、33和670cfu/mL。与传统细菌培养和单重PCR相比，本发明有检测速度快、成本低，灵敏度高、特异性强的特点，适合食品行业对大批量猪肉及猪肉产品在销售过程中致病菌的日常安全监测。

主权项

一种猪肉中主要致病菌五重PCR快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）提取待测肉样中总细菌DNA，（2）合成SEQ ID NO.1‑ SEQ ID NO.12所示的5种目标菌株的特异性靶基因和细菌16S rRNA内控基因所对应的引物；（3）以步骤（1）的总细菌DNA为模板，加入步骤（2）的6对引物，进行五重PCR反应，PCR产用2%琼脂糖进行电泳分析，根据电泳结果判断待测肉样中是否含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特氏菌和小肠结肠炎耶尔森菌；其中，多重 PCR 25 μL反应体系如下：Premix Taq 5 U/μL，0.125 μL；10×PCR Buffer（Mg²⁺ Free）2.5 μL，MgCl₂（25 μM）1.5 μL；dNTP Mixture  2.5 mM ，2 μL；各引物浓度分别为SEQ ID NO.1和SEQID NO.2、SEQ ID NO.5和SEQID NO.6均为0.24 μM、10 μmol/L； SEQ ID NO.3和SEQID NO.4、SEQ ID NO.9和SEQID NO.10均为0.16 μM、10 μmol/L； SEQ ID NO.7和SEQID NO.8为0.4 μM、10 μmol/L； SEQ ID NO.11和SEQID NO.12为0.04 μM、1 μmol/L；待测肉样中总细菌DNA模板2 μL，加灭菌蒸馏水至25 μL。