发明名称 |
基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系及其应用 |
摘要 |
本发明涉及一种基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系及其应用,该扩增体系在现有第二代超分支滚环扩增技术的基础上,通过引入一种特殊的核酸内切酶,即切刻内切酶Nb.BsrDI,从而发展出第三代滚环扩增技术,即网状滚环扩增技术(NRCA)。本发明的网状滚环扩增所产生的荧光信号强度随靶标DNA浓度的增加而增加,并且荧光信号强度明显高于线性滚环扩增和超分支滚环扩增,检测限达到0.1fM。该技术与第一代线性滚环扩增和第二代超分支滚环扩增相比,不仅保持了原有技术在操作性、使用成本、扩增所需时间等方面的优势,而且在原有技术基础上进一步实现了信号放大,从而为超低丰度核酸样本的分析检测提供了良好的技术条件,其应用前景非常广阔。 |
申请公布号 |
CN104212792A |
申请公布日期 |
2014.12.17 |
申请号 |
CN201410162336.8 |
申请日期 |
2014.04.22 |
申请人 |
上海大学 |
发明人 |
李根喜;朱小立;冯畅;佟蕙;张斌 |
分类号 |
C12N15/10(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I |
主分类号 |
C12N15/10(2006.01)I |
代理机构 |
上海上大专利事务所(普通合伙) 31205 |
代理人 |
陆聪明 |
主权项 |
一种基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系,其特征在于 该网状滚环扩增体系中有组成及浓度为:环状DNA模板 100 nM;靶标DNA 1 μM;引物 1 μM;dNTP 400 μM;Bst DNA聚合酶大片段 8 U;切刻内切酶Nb. BsrDI 10 U;1×Bst DNA聚合酶大片段缓冲溶液 v/v;所述的环状DNA模板是包含了三部分序列的环状碱基序列,第一部分是与标靶DNA序列互补的序列;第二部分是包含有切刻内切酶Nb. BsrDI的识别位点的所述的引物的序列相同的碱基序列;第三部分是随机序列,用于将第一部分序列与第二部分序列进行连接; 所述引物能与线性滚环扩增的产物结合,在Bst DNA聚合酶的作用下延伸并置换下游引物的延伸产物;所述的1×Bst DNA聚合酶大片段缓冲溶液中含有20 mM Tris‑HCl,10 mM KCl,10 mM (NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>,2 mM MgSO<sub>4</sub>,0.1% Triton X‑100,其pH 8.8。 |
地址 |
200444 上海市宝山区上大路99号 |