青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法检测试剂盒制备方法及检测方法

摘要

本发明的目的是提供一种基于青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法快速检测试剂盒的制备方法，及其使用检测方法，以解决传统ELISA方法检测β-内酰胺类药物时漏筛的问题。本发明公布了一种青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法检测试剂盒制备方法，以及一种采用青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法检测试剂盒对牛奶中β-内酰胺类药的含量的间接竞争受体法检测方法，本发明的有益效果是利用了青霉素结合蛋白6能与β-内酰胺类药物特异性结合的特点，能在缓冲液体系或者样本基质提取液中特异性地识别该类药物，不受到其它抗生素类如大环内酯类、喹诺酮类、四环素类的影响。

主权项

一种序列为SEQ ID NO.1所示的青霉素结合蛋白PBP6的β‑内酰胺类抗生素受体法检测试剂盒制备方法，步骤如下：1)青霉素结合蛋白6的重组表达载体的构建及蛋白表达(1)采用基因合成的办法合成青霉素结合蛋白6序列，根据合成的序列设计一对引物，在引物中引入酶切位点NdeI和XhoI，以合成的基因为模版进行PCR扩增，得到的基因扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳，电泳后通过胶回收试剂盒回收扩增产物。(2)回收的PCR产物和原核表达载体pET28a分别用NdeI和XhoI 37℃双酶切2h，酶切后用胶回收试剂盒进行回收；将回收的基因产物和pET28a用T4连接酶16℃连接2h，将连接产物全量转化DH5α感受态细胞，并涂布到含有卡那青霉素的LB平板上37℃倒置过夜培养；挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，将阳性单克隆提取质粒进行双酶切鉴定，将双酶切鉴定正确的单克隆进行DNA测序。(3)将构建成功的重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆摇菌做表达检测，通过SDS‑PAGE胶鉴定表达量高的单克隆菌株保存甘油菌。将甘油菌扩大培养，诱导表达后，收集表达菌体备用。(4)将菌悬液加入蛋白酶抑制剂，收集表达菌体，加入蛋白酶抑制剂，超声破碎后去除沉淀，上清滤膜过滤后以Ni亲和柱纯化，收集纯化的目的蛋白，以SDS‑PAGE胶检测纯度。将纯度大于90％的目的蛋白过夜透析浓缩脱盐后冻于液氮中备用。2)青霉素结合蛋白6特异性单克隆抗体的制备：将纯化好的青霉素结合蛋白6以50μg/次·只的量免疫Balb/C小白鼠，初次免疫时与弗氏完全佐剂(sigma，F5881)等量混合，后续免疫时将PBP6与弗氏不完全佐剂(sigma，F5506)等量混合；3次免疫后采血测定血清效价，后续每次免疫后均采集血清测定效价；待血清效价大于1:1000(OD450nm>1.5)后，以100μg/次/只的PBP6进行加强免疫，并于加强免疫后72小时内将小鼠处死，收集其脾细胞与SP2/0细胞株进行融合，制备能分泌PBP6单克隆抗体的杂交瘤细胞株；使用PBP6筛选阳性细胞株，选择显色较好的细胞株以体内法生产腹水抗体，并以亲和层析法进行纯化，收集纯化后的抗体储藏备用；3)辣根过氧化物酶标记青霉素结合蛋白6特异性单克隆抗体的制备：采用戊二醛法将辣根过氧化物酶(HRP)与PBP6单克隆抗体进行标记，具体操作如下：(1)称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，室温静置过夜；(2)反应后的酶溶液经SephadexG‑25层析柱，用生理盐水洗脱；流速控制在1ml/min，收集棕色流出液；如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml；放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌；(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中；(4)用1MpH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时；(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时；(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时；(7)3000rpm离心半小时，弃上清；沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中；(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为HRP‑PBP6，分装后，冰冻保存；4)采用戊二醛法合成包被原氨苄青霉素与牛血清白蛋白偶联物(AMP‑BSA)；5)制作青霉素结合蛋白PBP6的β‑内酰胺类抗生素受体法快速检测试剂盒将AMP‑BSA以包被缓冲液，其pH值为9.6，浓度为0.05M碳酸盐缓冲液，将其稀释到10μg/ml,以100μl每孔加入到酶标板中，37℃孵育2小时后，4℃过夜；甩干酶标板中的包被液，用洗涤缓冲液，其pH7.4，浓度为0.1M磷酸盐缓冲液，含有0.05％吐温20，洗板3次后，拍干备用；6)组装试剂盒试剂盒中的组份如下：标准品溶液：用PBS溶解并稀释的氨苄青霉素溶液，浓度为0，0.05，0.2，0.8，2.4和9.6μg/L；青霉素结合蛋白6溶液：以pH7.40.1M磷酸盐缓冲液稀释的PBP6，蛋白浓度为0.1mg/ml；辣根过氧化物酶标记PBP6单克隆抗体溶液：以PBS稀释3000倍，并含有0.05％的叠氮钠作为防腐剂；单组份TMB底物液；终止液：1M硫酸溶液。