一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法

摘要

本发明公开一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法。传统的检测方法检测时间长，耗时、耗力。本发明根据狐狸肉、老鼠肉、猪肉、鸡肉、鸭肉作为特征靶基因分别设计5对特异性引物：F1/R1、F2/R1、F3/R1、F4/R2、F4/R2。取样加水均质，制成组织匀浆样品；组织匀浆样品中提取DNA；PCR扩增，将扩增产物与6×LoadingBuffer混合，用2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。本发明根据五种肉类基因的同源性设计了6条引物，与传统方法比较，引物数量大为减少，从而减少了假阳性的出现；同时确认了该方法可以检测出0.1ng的DNA含量。

主权项

一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：根据狐狸肉、老鼠肉、猪肉、鸡肉、鸭肉作为特征靶基因分别设计5对特异性引物：F1/R1、F2/R1、F3/R1、F4/R2、F4/R2，即6条特异性引物：F1、F2、F3、F4、R1、R2；步骤(1).样品前处理：将肉类及其制品取样，加入10倍肉类及其制品体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质1min，制成组织匀浆样品；步骤(2).样品DNA提取：将50mg组织匀浆样品、200μl pH值为8.0的TE缓冲液涡旋混匀，加入400μl裂解液，混匀，然后加入600μl的第一混合溶剂剧烈振荡，12000g离心10min，取上清液加入与该上清液等体积的第二混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min，取上清液加入与该上清液等体积氯仿，剧烈振荡，12000g离心10min，取上清液加入与0.8倍该上清液体积的异丙醇，12000g离心l0min，得到沉淀物，用70﹪乙醇清洗沉淀物1次，在常温或50℃下，20min晾干，然后加入80μlpH值为8.0的TE缓冲液，使沉淀物溶解于TE缓冲液，得到DNA提取物；该DNA提取物即为模板DNA；将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；所述的TE缓冲液为1ml浓度为1M、pH值为8.0的Tris‑Cl，0.2ml浓度为0.5M、pH值为8.0的EDTA，定容至100ml溶液；所述的裂解液为Tris‑HCl、乙二胺四乙酸EDTA、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠SDS组成的混合液，其中Tris‑HCl的浓度为50mM、pH值为8.0，乙二胺四乙酸EDTA的浓度为25mM，NaCl的浓度为100mM，蛋白酶K的浓度为20μg/μL，十二烷基硫酸钠SDS的质量分数为10﹪；所述的第一混合溶剂为酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25：24：1；所述的第二混合溶剂为氯仿、异戊醇的混合液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1；步骤(3).多重PCR扩增：将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增,得到扩增产物；所述的PCR扩增反应体系为50μl由5.0μl的10×PCR Buffer、0.5μl浓度为2.5U/μl的Taq DNA聚合酶、4.0μl浓度为2.5mmol/L的dNTPs、6.5μl加入混合引物、2.0μl模板DNA和余量的灭菌蒸馏水组成；所述的多重PCR扩增反应的条件是94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min；所述的加入混合引物为5对特异性引物的混合引物，其中5对特异性引物的浓度比为F1:F2:F3:F4:R1:R2＝1:1:1:2:3:2；步骤(4).扩增产物电泳检测：PCR扩增反应结束后，将5μl扩增产物与1μl6×Loading Buffer混合，用2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果；所述的6条特异性引物具体是：F1:5’‑CTAGGGGTTTAGGTTAAACG‑3’；F2:5’‑CACCAAACAAAAACTAAACC‑3’；F3:5’‑GACAGCAGTATTACCATATAAC‑3’；F4:5’‑GAATCACCTTGACACTGATGCAC‑3’；R1:5’‑AGGGTATTTAGCTGTTAAC‑3’；R2:5’‑GCGGATACTTGCATGTATATGTC‑3’；其中狐狸特异性引物F1/R1扩增片段的长度为205bp，老鼠特异性引物F2/R1扩增片段的长度为283bp，猪特异性引物F3/R1扩增片段的长度为671bp，鸡特异性引物F4/R2扩增片段的长度为563bp，鸭特异性引物F4/R2扩增片段的长度为405bp。