MSCs、ASCs诱导的5-HT神经细胞及其微囊化制备方法与应用

摘要

MSCs、ASCs诱导的5-HT神经细胞，包括以下步骤：(1)MSCs或ASSCs培养与传代：①原代培养；②消化传代；(2)前体诱导；(3)功能诱导；(4)性能稳定培养。MSCs、ASCs诱导的5-HT神经细胞的微囊化制备方法，采用ANano-P-ANano(海藻酸钠+纳米微粒-聚氨酸-海藻酸钠+纳米微粒)法，经静电微囊发生器使MSCs、ASCs诱导的5-HT神经细胞微囊化微囊化；每微囊含20个或30个5-HT神经细胞组，使微囊内的细胞充分接触微囊壁，易于附着与营养交换，即制成微囊化诱导型5-HT神经细胞。微囊化诱导型5-HT神经细胞的应用，用于制备治疗抑郁症的药物或抗癌药物。本发明的微囊化诱导型5-HT细胞，该微囊化人5-HT神经细胞中枢移植疗法，将为临床治疗抑郁症及抗癌治疗提供新的途径。

主权项

一种利用MSCs诱导5‑HT神经细胞的方法，其特征在于，采用培养液将MSCs经分步培养诱导成为5‑HT神经细胞，包括以下步骤：(1)MSCs培养与传代：①原代培养；②消化传代；(2)前体诱导采用前体诱导液培养与诱导，将3代培养2天的细胞加入所述前体诱导液，隔日换液，培养4天；将MSCs诱导成突起变细、胞体和胞核趋于变圆的前体细胞，细胞鉴定Nestin阳性；所述前体诱导液的主要成分按照重量份数计：高糖DMEM1000ml、丙酮酸钠80～120mg、亚硒酸钠5～30μg、L‑谷氨酰胺250～350mg、2‑巯基乙醇3～5μl、NaHCO₃3～5g、HEPES5～7g、辅助诱导因子为碱性成纤维细胞生长因子bFGF100～200ng/脑源性神经营养因子BDNF100～200ng/全反式视黄酸ATRA5～10mg，(3)功能诱导采用功能诱导液培养与诱导，加隔离层成熟5‑HT神经细胞，隔日换液，培养6天，将前体细胞继续诱导成突起多、胞体和胞核变圆或多边形的5‑HT神经细胞，细胞鉴定微管相关蛋白2MAP2、特异性神经元核蛋白NeuN、5‑HT、TPH阳性、培养液放免测定其释放5‑HT浓度>15ng/ml；所述功能诱导液的主要成分按照重量份数计：高糖DMEM1000ml、丙酮酸钠80～120mg、亚硒酸钠5～30μg、L‑谷氨酰胺250～350mg、2‑巯基乙醇3～5μl、NaHCO₃3～5g、HEPES5～7g、B275～10ml、色氨酸1～5mg、辅助诱导因子为碱性成纤维细胞生长因子bFGF100～200ng/脑源性神经营养因子BDNF100～200ng/ATRA5～10mg，(4)性能稳定培养采用神经细胞培养液培养1天，细胞鉴定性能稳定，且释放5‑HT的功能旺盛，即成为MSCs诱导的5‑HT神经细胞，所述神经细胞培养液的主要成分按照重量份数计：NeuronalMedium1000ml、B2710～20ml、色氨酸5～10mg、辅助诱导因子为脑源性神经营养因子BDNF100～200ng。