基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法

摘要

本发明公开了基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法，特点是包括将0.1ng/ul的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原按100ul/孔加于聚苯乙烯96孔反应板中进行预包被，并采用牛血清白蛋白封闭液进行封闭的步骤；将每孔加入倍比稀释的甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体，并加入辣根过氧化酶标记的羊抗鸡IgG和邻苯二胺底物溶液显色反应的步骤；最后在酶标仪上读取各孔492nm波长处的吸光度值，测定孔吸光度值大于阴性对照孔均值2.1倍以上者判为阳性，优点是具有稳定性、特异性和灵敏度高、免疫干扰小、背景低等效果。

主权项

一种甲鱼系统性败血症球状病毒抗原的制备方法，其特征在于具体过程如下：选取患病甲鱼，取甲鱼内脏置于预先冰浴过的TNE缓冲液中，匀浆直至完全碎裂，将匀浆液在4℃，6000g条件下离心10min后，取上清液在4℃，8000g条件下离心20min，取再次离心所得上清液于4℃，35000g离心1.5h后获取一次沉淀物，将一次沉淀物的沉淀上层疏松部分用TM缓冲液小心冲洗掉，沉淀下层白色部分重悬于1ml的TM缓冲液中，4℃冰浴过夜；次日将过夜处理的沉淀重新悬浮起来，4℃下3500g条件下离心5min后，取上清液于4℃，38000g条件下离心1.5h获取二次沉淀物，将二次沉淀物的沉淀上层疏松部分小心去掉后，下层白色沉淀用少量TM缓冲液重悬后制成病毒悬浮液，即为甲鱼系统性败血症球状病毒抗原，其中TNE缓冲液的pH为7.5，配制终浓度如下：50mM Tris‑HCl，200mM NaCl，5mM EDTA，1mM PMSF；TM缓冲液的pH为7.5，配制终浓度如下：50mM Tris‑HCl，10mM MgCl₂，1mM PMSF。