磷硫酰化DNA的酶促合成方法

摘要

本发明涉及一种生物医药技术领域的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，该方法包括以下步骤：以DNA和L-半胱氨酸为底物，加入DNA磷硫酰化修饰酶蛋白或者含有DNA磷硫酰化修饰酶蛋白的全细胞裂解液，在合适条件下发生磷硫酰化修饰酶促反应，获得磷硫酰化修饰的DNA。本发明提供的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，能够实现对不同长度和不同来源的DNA进行可控的修饰，并且具有序列特异性和空间构象特异性，可用于分子生物学研究、基因治疗、基因疫苗等诸多领域。

主权项

一种磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，包括如下步骤：以DNA和L‑半胱氨酸为底物，加入DNA磷硫酰化修饰酶蛋白或者含有DNA磷硫酰化修饰酶蛋白的全细胞裂解液，在合适条件下发生磷硫酰化修饰酶促反应，获得磷硫酰化修饰的DNA； 其中，所述全细胞裂解液的制备包括如下步骤：接种沙门氏菌(Salmonella enterica)serovar Cerro87至LB培养基中，培养，收集菌体，用磷酸缓冲液洗涤所述菌体，用反应缓冲液重悬，冻融，超声破碎所述菌体，离心，取上清液，即获所述全细胞裂解液；所述反应缓冲液包括20mM Tris‑HCl、60mM KCl、10mM MgCl₂、1mM EDTA、2mM DTT、1mM PMSF和体积比为25％的甘油，所述反应缓冲液的pH为8.0；所述酶促反应包括如下步骤：制备短链DNA‑链霉亲和素复合体，向所述DNA‑链霉亲和素复合体中加入所述全细胞裂解液，再加入终浓度为1mM的ATP、0.1mM的PLP和0.1mM的Cys，常规条件下反应，离心终止反应，用磷酸缓冲液洗涤反应物； 其中，所述DNA磷硫酰化修饰酶蛋白的制备包括如下步骤：从沙门氏菌克隆DNA磷硫酰化修饰的酶蛋白基因，构建质粒表达载体，转化宿主细胞，诱导表达，裂解，镍柱亲和纯化，FPLC纯化，蛋白浓缩，即得所述DNA磷硫酰化修饰酶蛋白；所述沙门氏菌为沙门氏菌(Salmonella enterica)serovar Cerro87；所述酶促反应包括如下步骤：取基因组DNA和所述DNA磷硫酰化修饰酶蛋白置于反应缓冲液，并加入终浓度为1mM的ATP、0.1mM的PLP和0.1mM的Cys，30℃下进行反应，加入苯酚氯仿抽提，抽提后的上清加入异丙醇沉淀，洗涤，干燥，即获磷硫酰化修饰的DNA；所述反应缓冲液包括20mM的Tris‑HCl和10mM的MgCl₂，所述反应缓冲液的pH为8.0。