| 摘要 |
Способ количественного определения видового состава пропионовых бактерий, обитающих на коже человека, заключающийся в том, что из образца, полученного растиранием участка кожи стерильным ватным тампоном, смоченным щелочным фосфатным буфером, выделяют ДНК с использованием набора ДНК-экстран ЕХ-509, 100 мкл исследуемой суспензии бактериальных клеток помещают в пластиковые пробирки, перед началом выделения для контроля степени выхода РНК в образцы вносят 5×104 копий плазмиды Ptgt 2 в 5 мкл 10 мМ Трис-HCl буфера (рН 8.0), лизис клеток осуществляют 300 мкл 1% раствора SDS, содержащего 20 мМ Трис-HCl буфера (рН 8.0), 75 мМ NaCl и 25 мМ Na2EDTA в течение 10 мин при комнатной температуре, белки осаждают 100 мкл 7,5 М NH4(CH3COO) с последующим центрифугированием 12000g в течение 2 мин, супернатант переносят в пластиковые пробирки, ДНК осаждают равным объемом изопропанола при комнатной температуре, центрифугируют при 12000g в течение 2 мин, осадок ДНК промывают 75% этанолом и высушивают в пробирках на воздухе при комнатной температуре до полного испарения спирта, ДНК растворяют в 100 мкл 10 мМ Трис-HCl буфера (рН 8.0) при 65°C в течение 5 мин, и затем проводят количественную ПНР-реакцию с праймерами GCG TGA GTG ACG GTA ATG GGT A, TTC CGA CGC GAT САА ССА, FAM-AGC GTT GTC CGG АТТ TAT TGG GCG-BHQ1, АСА TGG АТС CGG GAG CTT С, АСС САА CAT СТС ACG АСА CG, R6G-CGG TTC АСА GGT GGT GCA TTG GC-BHQ2, GTC TGC ААС TCG АСС ССА Т, AGT ССТ ААТ ТАС CAG ТСС САС, ROX-ACC TGT GTG GGG GAG CCG TCG AAG-BHQ2, AGA ACT CTG AGC GCT AGC TGT AG, CGT AGA ACT AGC TGT AGC GCA, Cy5-AG CGG СТС СТА CTT CTG CAG GGG-BHQ2. |
