一种黄瓜雌性系育种的分子标记辅助选择方法

摘要

本发明公开了一种黄瓜雌性系育种的分子标记辅助选择方法，该方法是：利用黄瓜全雌品种240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品种3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及其F₂代分离群体筛选出与黄瓜全雌性基因紧密连锁的SSR标记引物；通过提取对照品种和待测种子幼苗基因组DNA，利用筛选出的SSR标记引物，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染，得到对照与待测样的凝胶图谱，根据凝胶上条带的相对位置，快速而准确地检测黄瓜全雌性基因的存在。本发明对黄瓜全雌品种240-1-2-2-3-1自交系和弱雌品种3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系进行SSR分子标记的筛选可有效开展黄瓜雌性系的分子标记辅助选育，提高选择效率和标准化程度，从而加快育种进程。

主权项

一种黄瓜雌性系育种的分子标记辅助选择方法，其特征在于所述的方法按以下步骤进行： （1）待检测黄瓜叶片样品的采集：将待检测黄瓜材料播种，待1‑2片真叶期时，取植株顶部较为幼嫩的叶片，每份0.5g，采集后现用或在‑20℃下冷冻保存；（2）选用黄瓜全雌品种240‑1‑2‑2‑3‑1 自交系、弱雌品种3‑5‑1‑3‑2‑1‑1‑1‑1‑2 自交系材料及其F₂代；（3）利用改良的CTAB法提取黄瓜叶片DNA，分别对黄瓜全雌品种240‑1‑2‑2‑3‑1自交系材料、弱雌品种3‑5‑1‑3‑2‑1‑1‑1‑1‑2自交系材料、F₂代、待测样品提取DNA：称取150mg新鲜的叶片，连同适配器、研磨球在液氮中预冷，使用MM301细胞破碎仪研磨成粉末状；研磨程序设定为：研磨时间1.5 min，研磨频率20Hz；研磨后加入事先预热至65℃的2×CTAB提取缓冲液700μl，浸透待测样品粉末并倒转离心管，使粉末充分散开，于65℃水浴保温30min，其间轻柔混合2‑3次；取出离心管，冷至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀，静置10min；12000rpm离心15 min；转移上清于另一离心管中，加入2/3体积的预冷异丙醇，轻缓颠倒混匀，室温放置15 min；12000rpm离心10min，去上清，将离心管倒置于吸水纸上，控干上清；用700μl的70%乙醇洗涤沉淀2次，室温下微干；加入300μl去离子水溶解沉淀；加入等体积的氯仿/异戊醇抽提2次；吸取上清，加入1/5体积的NaAc，2.5倍体积的预冷无水乙醇沉淀DNA，放置1h左右，12000rpm离心10min，去上清；用700μl的70%乙醇洗涤沉淀2次，通风干燥或者自然干燥；加入30μl 去离子水溶解DNA，保存于‑80℃超低温冰箱备用；制1%琼脂糖凝胶进行检测；用SMA3000微量紫外分光光度计测定提取DNA的浓度和纯度，将DNA稀释到所需浓度，分装，置于‑20℃保存备用；（4））获得与黄瓜全雌性相关基因的分子标记：对黄瓜全雌品种240‑1‑2‑2‑3‑1自交系和弱雌品种3‑5‑1‑3‑2‑1‑1‑1‑1‑2自交系及其F₂代DNA样本进行SSR分子标记分析；选用699对SSR引物进行PCR扩增，PCR扩增反应总体系为20μl，扩增反应体系成分为：黄瓜基因组DNA20ng，10 pmol/μl引物各0.4μl，2.5 mM Mg²⁺ 2μl，2mM dNTP 1μl，5 U/μlTaq DNA 聚合酶0.1μl，10×buffer2μl，加无菌重蒸水补齐至20μl；PCR反应扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94℃变性30sec，按特定引物特定温度退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸10min；在20 μl的PCR扩增产物中加入8μlLoading Buffer 94 ℃变性5min，迅速置于冰上冷却；每样品各取6μl上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶上，在恒定100W功率下电泳至溴酚蓝到达凝胶另一端；银染后，在胶片观察灯上照相、观察，对在亲本间表现出共显性分离的引物利用F₂代强雌和弱雌混合基因池进行再次筛选，从而获得与黄瓜全雌性紧密连锁的一个SSR多态性片段，其标记引物为CSWCT25，其正向引物序列：5′‑ AAAGAAATTAAGTCAATCAAACCG‑3′，反向引物序列：5′‑ CCCACCAATAGTAAAATTATACAT ‑ 3′；利用获得的标记引物对待测样品DNA样本进行PCR扩增，对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析，获得待测样品多态性片段，根据凝胶上谱带的相对位置，选择电泳带型与供体亲本相同的单株，结合田间鉴定和其他育种目标性状的选择，选择出具有全雌性特征的优良单株。