一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法

摘要

本发明公开了一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法：从9种微生物中，通过底物诱导筛选出高产没食子酸脱羧酶(GAD)的产气肠杆菌(Enterobacer aerogenes)菌株；经过考察发酵时间、接种量、发酵温度、底物浓度、初始发酵液pH值等单因子以及3因素3水平的响应面分析和模型修正，确定该降解菌株的最佳发酵条件，并进行验证；再通过溶剂萃取和中压柱分离，得到质量分数98％以上的焦性没食子酸，为微生物法降解没食子酸生产焦性没食子酸的工业化生产提供一定的实践基础。

主权项

一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法，其特征在于由以下步骤组成：第一步，培养基制备(1)种子培养基称取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaCl5.0g在1L容量瓶，加蒸馏水定容至刻度，用1mol/L盐酸将pH值调至6.5～7.0，在121℃下灭菌20min，冷却后为种子培养基；(2)试管斜面保藏培养基称取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaCl5.0g、琼脂15.0g，在1L容量瓶，加蒸馏水定容至刻度，用1mol/L盐酸将pH值调至6.5～7.0，在121℃下灭菌20min，冷却后为试管斜面保藏培养基；(3)发酵培养基成团泛菌发酵培养基：0.3％没食子酸、0.5％丙三醇、0.5％蛋白胨、0.001％FeSO₄.7H₂O、0.1％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄·7H₂O、1.0％酵母提取物；弗氏柠檬酸杆菌发酵培养基：2.0％没食子酸、0.2％(NH₄)₂HPO₄、0.1％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄·7H₂O、0.05％酵母提取物；克雷伯氏菌发酵培养基：1.0％没食子酸、3.0％C₁₃H₁₅N₃O₂(4‑氨酰安替比林)、2.0％(NH₄)₂SO₄、0.8M饱和Na₂B₄O₇·10H₂水溶液、0.5M Na₂HPO₄·12H₂O缓冲溶液(pH7.2可由12.535g Na₂HPO₄·12H₂O或者4.969g Na₂HPO₄与2.340g NaH₂PO₄·2H₂O溶于100mL蒸馏水制得)；氧化还原真杆菌发酵培养基：30mM C₆H₇O₈Na、30mM HCOONa·2H₂O、1％细菌琼脂粉、0.2％没食子酸；植物乳杆菌、解没食子酸链球菌发酵培养基：包含5.0％去纤维蛋白的马血、20mM没食子酸的肉汤培养基；黏红酵母菌发酵培养基：0.5％C₆H₁₂O₆、0.9％NaCl、0.5mM没食子酸、0.5％酵母提取物；肠杆菌属、产气肠杆菌属发酵培养基：0.06％MgSO₄·7H₂O、0.4％(NH₄)₂SO₄、0.2％～0.5％没食子酸、0.5％麦芽糖并取30mM pH值为6.0～7.0的磷酸盐缓冲溶液，其中没食子酸于100℃下灭菌5min，麦芽糖于115℃下灭菌30min，其余成分在121℃下灭菌20min，制备发酵培养基；第二步，没食子酸脱羧酶(GAD)的高产菌种筛选初筛的方法：将培养好的克雷伯氏菌(K.aerogenes)、产气肠杆菌(E.aerogenes)、肠杆菌属(E.sp.)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、成团泛菌(P.agglomerans)、氧化还原真杆菌(E.oxidoreducens)、植物乳杆菌(L.planetarium)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)、黏红酵母菌(R.glutinis)等菌液，分别放入相应的发酵培养基中培养发酵，如肠杆菌属(E.sp.)、产气肠杆菌(E.aerogenes)的发酵培养基如第一步中所示，温度30～37℃，每隔12h取样一次，然后取用3倍体积的乙醚萃取发酵液3次，合并萃取液，减压浓缩，制备乙酸乙酯萃取物，经TLC和HPLC分析没食子酸和焦性没食子酸，筛选出高产没食子酸脱羧酶(GAD)的产气肠杆菌(E.aerogenes)、肠杆菌属(E.sp.)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)和黏红酵母菌(R.glutinis)；第三步，菌种底物诱导配制CDM缺碳培养基：0.06％MgSO₄·7H₂O、0.4％(NH₄)₂SO₄、0.2％没食子酸及30mM pH值为6.6的磷酸盐缓冲溶液，将培养好的斜面菌种以无菌操作取两环，转接到100mL CDM培养基的250mL摇瓶中，在水浴温度为25～30℃，转速为180～200r/min的摇床中培养，每12h取样一次，HPLC检测发酵液中没食子酸和焦性没食子酸；第四步，种子液制备及发酵培养将培养好的斜面菌种以无菌操作取五环，转接到100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，温度30～40℃，静置培养6～8h，将培养好的菌液按照4～6％接种量，转接到发酵培养基中，温度30～35℃，180～200r/min摇床培养50～70h；第五步，摇瓶生理胁迫培养及响应面优化通过考察接种量、发酵时间、磷酸盐浓度、底物浓度、发酵温度、发酵液起始pH值等因素对焦性没食子酸的收率的单因素影响，采用Box‑Behnken实验设计进行3因素(底物浓度、发酵温度、发酵液起始pH值)3水平的响应面优化，并进行验证；第六步，发酵液中焦性没食子酸提取取第五步最佳工艺条件下发酵液原液，于6000r/min条件下离心20min，取上清液用其体积3倍的有机溶剂萃取3次，合并萃取相、浓缩，得焦性没食子酸浓缩物；第七步，中压柱分离制备将焦性没食子酸浓缩物与中压柱填料按质量比1∶10～30吸附，洗脱剂为甲基叔丁基醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇和水中的1种或几种的混合溶液，中压柱柱长20～300cm，柱直径2～30cm，柱压为3～10MPa，检测波长220～360nm，流速2～100mL/min，富集焦性没食子酸，室温真空回收溶剂，经HPLC分析，制备得到98％以上焦性没食子酸。