一种¹⁹F核磁共振探针及其制备方法

摘要

本发明公开了一种¹⁹F核磁共振探针及其制备方法，特征是采用固相合成法将两个肽段分别合成出来，得到具有第一类特征结构(Ⅰ)的第一种化合物X₁和第二种化合物X₂能够被弗林蛋白酶特异性识别剪切发生自组装缩合反应；具有第二类特征结构(Ⅱ)的第三种化合物Y₁和第四种化合物Y₂不能被酶识别不能发生自组装反应的对照化合物；第二种化合物X₂和第四种化合物Y₂中含有¹⁹F原子，可用来做体外验证实验和细胞摄取实验。本发明的探针是小分子，亲水性好，制备容易；该探针的前体小分子有弗林蛋白酶特异性识别的肽段可主动靶向所需检测的酶，实现在体外和活体细胞内控制性自组装含¹⁹F原子的纳米结构，研究肿瘤细胞内弗林蛋白酶的活性。

主权项

一种¹⁹F核磁共振探针的制备方法，其特征在于：第一步、先采用固相合成方法分别合成两段肽链，过程如下，按：将1毫摩尔2‑氯三苯甲基氯树脂在4‑6毫升N，N‑二甲基甲酰胺里溶胀4‑8分钟后，加入2毫摩尔第一个氨基酸赖氨酸，再加入2毫摩尔N，N‑二异丙基乙胺，反应2‑3小时后，用100微升甲醇反应10‑20分钟，切去赖氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第二个氨基酸半胱氨酸反应2‑3小时，切去半胱氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸精氨酸反应2‑3小时，切去精氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸精氨酸反应2‑3小时，切去精氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第五个氨基酸缬氨酸反应2‑3小时，切去缬氨酸的保护基，再加入活化的1.6毫摩尔第六个氨基酸精氨酸反应3‑4小时，切去最后一个氨基酸精氨酸的保护基，加2‑3毫摩尔醋酐反应20‑30分钟，最后用含体积浓度为1％的三氟乙酸的二氯甲烷从该树脂上切下上述合成的肽段，用乙醚层出冷冻离心倾去上层乙醚，待溶剂挥发干之后所得到的白色固体粉末即是赖氨酸‑半胱氨酸‑精氨酸‑精氨酸‑缬氨酸‑精氨酸肽段；再将1毫摩尔2‑氯三苯甲基氯树脂在4‑6毫升N，N‑二甲基甲酰胺里溶胀4‑8分钟后，加入2毫摩尔第一个氨基酸缬氨酸，再加入2毫摩尔N，N‑二异丙基乙胺，反应2‑3小时后，用100微升甲醇反应10‑20分钟，切去缬氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第二个氨基酸精氨酸反应2‑3小时，切去精氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸半胱氨酸反应2‑3小时，切去半胱氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸精氨酸反应2‑3小时，切去精氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第五个氨基酸赖氨酸反应2‑3小时，切去赖氨酸的保护基，再加入活化的1.6毫摩尔第六个氨基酸精氨酸反应3‑4小时，切去最后一个氨基酸精氨酸的保护基，加2‑3毫摩尔醋酐反应20‑30分钟，最后用体积浓度为1％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液从该树脂上切下上述合成的肽段，采用乙醚层出冷冻离心倾去上层乙醚，待溶剂挥发干之后所得到的白色固体粉末即是缬氨酸‑精氨酸‑半胱氨酸‑精氨酸‑赖氨酸‑精氨酸肽段；第二步、将上述合成的赖氨酸‑半胱氨酸‑精氨酸‑精氨酸‑缬氨酸‑精氨酸肽段取0.1毫摩尔溶于2毫升四氢呋喃溶剂中，加入0.15毫摩尔N‑甲基吗啡，冷却至零度时加入0.12毫摩尔氯甲酸异丁酯，活化半小时后，加入0.12毫摩尔2‑氨基‑6‑氰基苯并噻唑，保持温度在0℃一个小时，室温搅拌反应过夜，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外320纳米处有强吸收的组分，即为第一类初产物；再将上述合成的缬氨酸‑精氨酸‑半胱氨酸‑精氨酸‑赖氨酸‑精氨酸肽段取0.1毫摩尔溶于2毫升四氢呋喃溶剂中，加入0.15毫摩尔N‑甲基吗啡，冷却至零度时加入0.12毫摩尔氯甲酸异丁酯，活化半小时后，加入0.12毫摩尔2‑氨基‑6‑氰基苯并噻唑，保持温度在0℃一个小时，室温搅拌反应过夜，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外320纳米处有强吸收的组分，即为第二类初产物；第三步、先将上述制备的第一类初产物溶解在5毫升体积浓度为95％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中搅拌反应2小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外320纳米处有强吸收组分即为终产物第一种化合物X₁；再将第二类初产物溶解在5毫升体积浓度为95％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中搅拌反应2小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外320纳米处有强吸收组分即为终产物第三种化合物Y₁；第四步、将1毫摩尔终产物第一种化合物X₁溶解在2毫升N，N‑二甲基甲酰胺中，加入1毫摩尔1‑羟基苯并三唑，1毫摩尔苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸盐，2毫摩尔N，N‑二异丙基乙胺以及1.5毫摩尔3,5‑双(三氟甲基)苯甲酸，室温下搅拌反应过夜，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外320纳米处有强吸收组分即为终产物第二种化合物X₂；再将1毫摩尔终产物第三种化合物Y₁溶解在2毫升N，N‑二甲基甲酰胺中，加入1毫摩尔1‑羟基苯并三唑，1毫摩尔苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸盐，2毫摩尔N，N‑二异丙基乙胺以及1.5毫摩尔3,5‑双(三氟甲基)苯甲酸，室温下搅拌反应过夜，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外320纳米处有强吸收组分即为终产物第四种化合物Y₂；其中固相所用的氨基酸都是以9‑芴甲氧羰基作为α‑氨基保护基，赖氨酸的侧链氨基保护基为叔丁氧羰基，半胱氨酸的巯基由叔丁硫基保护，精氨酸侧链氨基由保护；其中活化氨基酸的试剂是与氨基酸同物质的量的1‑羟基苯并三唑和苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸盐；在每接上一个氨基酸和切去保护基时，都要用凯撒测试试剂检测亚氨基存在与否：若阳性显蓝色，即表明保护基团已剪切完；若阴性显黄色，则表明氨基酸已接上。