主权项 |
一种简便的植物BY‑2细胞冷冻保存方法,其特征在于,它包括如下步骤:A.预培养:将烟草叶片的愈伤组织在含8%的蔗糖液体培养基中预培养5天;B.冷冻保护剂的预处理:将预培养后的细胞悬浮液4℃800rpm离心5min,吸去上清液后保留2ml细胞液转移至冷冻保藏管中,然后在保留的细胞液中加入冷冻保护剂,密封;C.加入冷冻保护剂:冷冻保护剂包括50%山梨醇0.572ml、二甲基亚砜0.286ml、细胞悬浮液2ml,其中,山梨醇经过高压蒸汽灭菌,二甲基亚砜经过紫外灯灭菌;D.降温冷冻程序:采用分步冷冻法:将预处理后的材料降温至4℃下静置预处理30min,再在‑20℃,停留30min,再‑40℃,静置3h,最后将处于冷冻保藏管中的细胞放置‑80℃中保存;E.冷冻保藏后的细胞复苏的培养步骤:(1)取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉;(2)将新鲜培养液置于37℃水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭盛装培养液的容器,移入无菌操作台内;(3)取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1min内全部融化,以70%酒精擦拭保藏管外部,移入无菌操作台内;(4)取出解冻的细胞悬浮液,缓缓加入有培养基的培养容器内,稀释比例为1:10,混合均匀,放入培养箱培养;(5)在解冻培养后隔日更换培养液。 |