基于量子点/氧化石墨烯纳米平台的单增李斯特菌多基因检测方法

摘要

本发明公开一种基于量子点/氧化石墨烯纳米平台的单增李斯特菌多基因检测方法，属于基因纳米检测技术领域。该单增李斯特菌多基因检测方法通过选择单增李斯特菌两个或者两个以上的基因作为基因检测的靶点，根据基因保守区分析结果，设计两对或者两对以上基因的PCR扩增引物，通过LATE-PCR的原理，同时扩增两个或者两个以上基因的特定序列，得到相应的单链扩增产物；然后，再让单链扩增产物与量子点荧光探针杂交，最后用氧化石墨烯去淬灭掉未杂交的量子点探针，当目标基因不存在时，所有的量子点荧光探针都会被淬灭；相反当目标基因存在时，就会得到相对应的荧光信号。利用该检测方法对单增李斯特菌的检测可靠性高。

主权项

一种基于量子点/氧化石墨烯纳米平台的用于检测食品中单增李斯特菌多基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)引物设计对目标基因进行分析，确定目标基因的保守区；利用引物设计软件分别对hlyA和iap基因进行引物设计；设计引物时，保持限制引物的退火温度高于过量引物5～10℃；引物序列见下表：引物名称引物序列理论退火温度hly A限制引物GCTGCCGTAAGTGGGAAATCTGTCTCAG70.4℃hly A过量引物ATGATTTGAACTTCATCTTTTGC59.9℃iap1限制引物AACAAGCTGCACCTGCTGCAGA70.3℃iap2过量引物CTTTTGACAGCGTGTGTAGT61.9℃2)基因组提取将单增李斯特菌菌种加入液体培养基中培养；对培养的单增李斯特菌进行基因组DNA抽提；3)验证引物可行性通过PCR实验，扩增目标基因；对扩增产物进行电泳检测，选择选择电泳条带清晰且特异性好的引物作为LATE‑PCR的扩增引物；4)优化LATE‑PCR对引物浓度比例位于1：50‑100范围内的多组引物进行PCR反应，产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测，选择特异性较好、扩增效率高的引物作为LATE‑PCR的引物；5)量子点荧光探针的制备选用两种或两种以上荧光发射峰不同的量子点，其表面分别标记链霉亲和素；将表面标记有链霉亲和素的量子点分别与5'生物素标记的DNA探针混匀，避光孵育，使表面标记有链霉亲和素的量子点与5'生物素标记的DNA探针充分结合，形成量子点荧光探针；再通过分子筛超滤使游离的DNA探针与量子点荧光探针分离，将分离后的量子点荧光探针溶解于磷酸盐缓冲液中；6)多元LATE‑PCR实验根据步骤4)优化的引物比例添加引物，建立LATE‑PCR反应体系，以同时扩增出多基因的单链产物，并适当调整不同基因间的引物配比，使不同基因的扩增效率相一致；7)杂交实验取步骤5)中制备的量子点荧光探针与步骤6)中的多元LATE‑PCR扩增产物相混匀，进行杂交；然后，取适量的氧化石墨烯淬灭未杂交、游离的量子点荧光探针，最后用分光光度计检测信号。