滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度的分子鉴定方法及其专用引物

摘要

本发明公开了滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度的分子鉴定方法及其专用引物，该方法包括扩增模板DNA为叶片，用序列表所示的四对引物对待鉴定水稻的叶片进行PCR扩增，依据电泳结果，即可鉴定出滇型杂交粳稻滇杂31种子中杂株数量，准确率为99%以上；还可对混杂株的真实性（基因型）进行了鉴定，确定杂株的混杂类型，能有效指导在生产过程中减少母本保持系、母本育性回复株、籼稻以及籼粳杂交种混杂发生，为制备高纯度的杂交种子提供理论支持。其中一对引物还可以用于水稻材料的籼粳分化鉴定。本发明方法简单易行，不受季节的限制，避免了田间形态鉴定的繁琐程序，鉴定成本低。

主权项

滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度的分子鉴定方法，包括以下步骤：(1) 以滇型杂交粳稻滇杂31杂交种子为对照材料，取对照材料和200粒以上的待鉴定水稻种子于20℃～35℃条件下发芽；(2) 发芽后水培7～10天，分别取所述的对照材料的叶片为对照样品和待鉴定水稻的叶片为待鉴定样品，每个样品分成4等份，4等份分别加入试剂1、试剂2、试剂3、试剂4后，按常规PCR反应程序进行PCR扩增；所述的试剂1、试剂2、试剂3和试剂4均是在相同的常规PCR反应体系分别加入不同的引物，试剂1为常规PCR反应体系加入DZ31‑1引物，试剂2为常规PCR反应体系加入DZ31‑2引物，试剂3为常规PCR反应体系加入DZ31‑3引物，试剂4为常规PCR反应体系加入DZ31‑4引物；(3) 对PCR扩增产物用含EtBr 0.1μg/ml的2%琼脂糖凝胶电泳分离；(4) 在紫外透射仪上检测PCR扩增产物及电泳结果，依据电泳结果，按如下①至④步的鉴别即鉴定出滇型杂交粳稻滇杂31种子中杂株数量：    ①用DZ31‑1引物扩增后，滇型杂交粳稻滇杂31的杂交种分子量为442bp和521bp，基因型为杂合型，其它类型分子量的为杂株； ②用DZ31‑2引物扩增后，滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为346bp，其它类型分子量的为杂株； ③用DZ31‑3引物扩增后，滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为428bp，其它类型分子量的为杂株；④用DZ31‑4 引物扩增后，滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为350bp，其它类型分子量的为杂株；所述的DZ31‑1引物由上游引物DA31‑1‑F和下游引物DA31‑1‑R组成，上游引物DA31‑1‑F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，下游引物DA31‑1‑R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；所述的DZ31‑2引物由上游引物DZ31‑2‑F和下游引物DZ31‑2‑R组成，上游引物DZ31‑2‑F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，下游引物DZ31‑2‑R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示；所述的DZ31‑3引物由上游引物DZ31‑3‑F和下游引物DZ31‑3‑R组成，上游引物DZ31‑3‑F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，下游引物DZ31‑3‑R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：6所示；所述的DZ31‑4引物由上游引物DZ31‑4‑F和下游引物DZ31‑4‑R组成，上游引物DZ31‑4‑F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，下游引物DZ31‑4‑R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。