一种顶头孢霉蛋白质组的制备方法

摘要

本发明公开了一种顶头孢霉蛋白质组的制备方法，包括以下步骤：将顶头孢霉菌体用液氮研磨成粉末状后，用TCA-丙酮沉淀法提取总蛋白样品；将所得的总蛋白样品与水化溶液混合后，水化上样，采用IPG固相胶条，然后进行等电聚焦，等电聚焦完成后，将胶条平衡后转移至SDS-PAGE凝胶上，进行电泳，当溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳，得凝胶；将所得的凝胶经染色后，用凝胶扫描仪透射扫描，将得到的图像用软件进行分析。头孢菌素C在生产头孢类抗生素中具有重要地位，可由此开展对顶头孢霉的蛋白质组学研究，为优化头孢菌素产生菌的分子育种及代谢工程打下基础，具有重要的意义。

主权项

一种顶头孢霉蛋白质组的制备方法，包括以下步骤：将顶头孢霉菌体用液氮研磨成粉末状后，用TCA‑丙酮沉淀法提取总蛋白样品；将所得的总蛋白样品与水化溶液混合后，水化上样，采用IPG固相胶条，然后进行等电聚焦，等电聚焦完成后将胶条平衡，然后转移至SDS‑PAGE凝胶上进行电泳，当溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳，得凝胶；将所得的凝胶经染色后，用凝胶扫描仪透射扫描，将得到的图像用软件进行分析，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)制备顶头孢霉双向电泳的蛋白质样品a.将顶头孢霉菌体用液氮研磨成粉末状，b.加入预冷的含有20mmol/L DTT的10％TCA丙酮溶液混匀后置于‑20℃中沉淀过夜；c.在4℃下，12000rpm离心25分钟，弃上清，取沉淀；d.沉淀放于室温风干；e.在沉淀中加入双向电泳样品裂解液，室温条件下浸提2小时；f.在4℃12000rpm下离心20min，取上清，即得顶头孢霉胞内蛋白质样品，测总蛋白浓度，分装，贮存于‑80℃；其中，所述双向电泳样品裂解液：7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，2％IPG缓冲液，40mMDTT；(2)双向凝胶电泳取步骤(1)所得的总量为1mg的蛋白样品与水化溶液混合成总量为450μl的上样液，水化上样，所述的总蛋白样品进行水化上样时上样液中DTT的浓度是1～2mM，IPG缓冲液的浓度是0.5％～2％，均匀泡涨24cm的IPG固相胶条，所述的IPG固相胶条是线性固相干胶条pH4‑7，将泡涨后胶条转移至胶条槽中，进行等电聚焦；等电聚焦完成后，将胶条在平衡液I中平衡15分钟，再在平衡液II平衡15分钟，将平衡后胶条转移至SDS‑PAGE凝胶上，进行电泳，当溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳，得凝胶；其中，所述水化溶液：8M尿素，2％CHAPS，0.5％IPG缓冲液，18mMDTT，0.002％溴酚蓝；SDS平衡母液：6M尿素，75mM Tris‑Cl pH8.8，29.3％甘油，2％SDS，0.002％溴酚蓝；平衡液I：SDS平衡母液中加入DTT0.1mg/胶条；平衡液II：SDS平衡母液中加入碘乙酰胺0.25mg/胶条；(3)图像采集分析将步骤(2)所得的凝胶经染色后，用凝胶扫描仪透射扫描，将得到的图像用软件进行分析。