利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号传导寡核苷酸杂交的靶核酸序列的检测

摘要

本发明涉及利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号传导寡核苷酸杂交(PCE-SH，PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization)的靶核酸序列的检测。本发明不使用与靶核酸序列杂交来提供靶信号的探针。本发明利用与以靶-依赖性的方式形成的延伸链杂交的探针(信号传导寡核苷酸)，将具有人为选择的序列的捕捉和模板化寡核苷酸作为模板合成上述延伸链。

主权项

一种利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸‑依赖性信号传导寡核苷酸杂交来从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及探测和标记寡核苷酸进行杂交；上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’‑靶向部位，其包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及(ii)5’‑标记部位，其包含与上述靶核酸序列非‑互补的核苷酸序列；上述探测和标记寡核苷酸的3’‑靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述探测和标记寡核苷酸的5’‑标记部位不与上述靶核酸序列杂交；上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸的上游；步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；上述上游寡核苷酸或者其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的上述酶的上述探测和标记寡核苷酸的切割，来放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’‑标记部位或者5’‑标记部位的一部分的片段；步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交；上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，其包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’‑标记部位互补的核苷酸序列或者与5’‑标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，其包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’‑标记部位以及3’‑靶向部位非‑互补的核苷酸序列；从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；步骤(d)，利用模板‑依赖性核酸聚合酶及上述步骤(c)的结果物来实施延伸反应；与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段被延伸，来生成包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸序列的延伸链，由此形成延伸二聚物；步骤(e)，使上述延伸链与信号传导寡核苷酸杂交的步骤；上述信号传导寡核苷酸包含与上述延伸链互补的序列，并与至少一个标记相结合，且上述信号传导寡核苷酸与上述延伸链杂交来提供能够检测的信号；以及步骤(f)，检测上述信号；上述信号的检测表示上述延伸链的存在，且上述延伸链的存在表示上述靶核酸序列的存在。