一种香菇L9319菌种的SSR标记指纹图谱与应用

摘要

本发明涉及一种香菇L9319菌种的SSR标记指纹图谱与应用，该指纹图谱由7对基于香菇基因组序列开发的SSR标记的特异等位片段组合而成。应用包括：对香菇菌种进行SSR标记扩增，将得到的带型与指纹图谱对照，与该指纹图谱一致即为香菇L9319菌种。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的我国25个国审的香菇主栽菌种中具有香菇L9319菌种的专一性。

主权项

一种香菇L9319菌种的鉴定方法，其具体步骤如下：(1)菌丝培养：将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基中，23℃～25℃下避光摇瓶培养，3d～4d后收集菌丝；(2)基因组DNA的提取：用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：①将液氮冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45～60min，间或轻摇混匀；②12000rpm、4℃离心20min，取上清液；③在上述上清液中加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；④在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；⑤在上述离心管中加入2/3体积的‑20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；⑥将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；⑦加入预冷的95vol％乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；⑧加入100μL10×TE缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；⑨加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；⑩将得到的DNA提取物于‑20℃冰箱贮藏备用；(3)SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCR buffer2μL，25mmol/L MgCl₂2μL，10mmol/L dNTP0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL，浓度20ng～30ng/μL提取的模板DNA2μL，ddH₂O10.4μL；PCR反应条件：94℃5min；94℃30second，55℃30second，72℃30second，30个循环；72℃5min；(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与2μL加样缓冲液混匀，于95℃变性5min，结束后置于冰水混合物中冷却3min，点样3μL于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6％，电泳缓冲液为1×TBE，电压1000v，电流200mA，功率200W，电泳45min，银染，显色，拍照，分析结果；银染的具体工艺为电泳完成后卸下并拆开玻璃板，胶板卸下后，用去离子水水洗5‑8秒，沥干水分后，在银染液中避光银染8分钟，银染后，用去离子水水洗5‑8秒，沥干水分，放入显影液中，至显影后取出水洗后即可读数；采用7对SSR引物对香菇菌株进行PCR扩增，通过对照50bp DNA ladder可确定各SSR引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，即可确定该菌种为香菇L9319菌种；其中，7对SSR引物序列以及扩增的等位片段的数量和相对分子量如下：Le_fp0001的正/反向引物分别为：ACGCGTATCCTCCCCTAAGT/AAGCGATATGGATTTGACGC；等位片段的数量1，相对分子量600bp；Le_fp0002的正/反向引物分别为：GGGCGAAACAATTTCAGGTA/ATGCCATCGTAAGGAACTCG；等位片段的数量1，相对分子量290bp；Le_fp0003的正/反向引物分别为：ATTGTGACTCGACCACCTCC/TCATAATGCATCCCGTGAGA；等位片段的数量2，相对分子量900bp、800bp；Le_fp0004的正/反向引物分别为：CCCAAAAAGGATTTCAGCAA/AACCGGAGTGGTGTAAGTGC；等位片段的数量1，相对分子量400bp；Le_fp0005的正/反向引物分别为：CATCAACCAAACCAAGATTCAA/TTCCAATTTCCTCCGAGTCA；等位片段的数量1，相对分子量720bp；Le_fp0006的正/反向引物分别为：CATGGGAGAGATTCGGAAAA/CGAGACCGACGACTTTGACT；等位片段的数量2，相对分子量800bp、780bp；Le_fp0007的正/反向引物分别为：CATTGCTCGGATCCTTCATT/TACCTCGTGCGGACTTTGAT；等位片段的数量2，相对分子量700bp、600bp。