一种利用探针熔解技术准确检测KRAS基因突变的方法

摘要

本发明提出一种利用探针熔解技术准确检测KRAS基因突变的方法，不仅节省了耗材，同时具有高灵敏度，高特异性的特点，检测结果更可靠。该方法包括以下步骤：（1）分子信标探针和模板扩增引物的设计及合成，其中设计的上游引物(22nt)为5’-CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTC-3’，延伸阻滞引物(36nt)为5’-taAGGTCAAGAGGACTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3’，分子信标探针(34nt)为FAM-acgcATTGTACTCCTCTTGACCTGCTGTatgcgt-BHQ2；（2）提取被测样本的基因组DNA；（3）配制反应体系；（4）PCR反应。

主权项

一种利用探针熔解技术准确检测KRAS基因突变的方法，应用于非疾病诊断目的，该检测方法包括以下步骤：（1）分子信标探针和模板扩增引物的设计及合成上游引物(22nt):5’‑CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTC‑3’延伸阻滞引物(36nt):5’‑taAGGTCAAGAGGACTCATGTACTGGTCCCTCATTG‑3’分子信标探针(34nt):FAM‑acgcATTGTACTCCTCTTGACCTGCTGTatgcgt‑BHQ2（2）提取被测样本的基因组DNA；（3）配制反应体系在反应管中加入被测样本的基因组DNA、上游引物、延伸阻滞引物、UNG酶(尿嘧啶‑N‑糖基化酶)、5’→3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM^TM Taq DNA Polymerase)，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脱氧尿苷三磷酸)、分子信标探针、10×PCR Buffer(TIANNIUMTM Taq PCR Buffer)；（4）PCR反应将配制好的反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增和熔解，PCR反应完成后进行熔解曲线分析，通过熔解峰的Tm值判断出被测样本中是否发生了KRAS突变。