BCL10基因突变的快速检测方法

摘要

本发明提供了一种BCL10基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤：设计一对引物将包括待突变位点在内的基因序列扩增出来作为野生型模板；再设计引物在将待突变位点改变成所需碱基的同时，将上述DNA片段在待突变点分为两段，且在待突变位点附近有少量重复序列；最后利用部分重复的两个DNA片段混合起来作为模板，而利用最开始的那对引物将两个小片段连接起来，其产物即含有所述的突变点；不同比例混合上述两种片段，用HRM方法进行区分；与其它方法相比，本发明方法具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。

主权项

一种BCL10基因突变的快速检测方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；DNA提取：取200μL抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；qPCR‑HRM检测，包括：1)对照的设立和检测重复孔：样本检测的同时设有对照实验，包括野生型阴性对照和突变m/野生w＝1％阳性对照；对照和样本均采用复孔；设计一对引物将包括待突变位点在内的基因序列扩增出来作为野生型模板，所述引物是BCL2F和BCL2R，引物BCL2F的核苷酸序列为：CACTGAAGAAATTTCTTGTCGAACA，引物BCL2R的核苷酸序列为AAAAGCATTATTACATTTAAATTAGCTC；再设计引物在将待突变位点改变成所需碱基的同时，将上述DNA片段在待突变点分为两段，且在待突变位点附近有少量重复序列，所述引物是BCL2MF和BCL2MR，引物BCL2MF的核苷酸序列为GGGCTGGAAAATGTTAGACTAC，引物BCL2MR的核苷酸序列为GTAGTCTAACATTTTCCAGCCC；野生型目的片段的获取：以已知未突变基因组为模板，BCL2F和BCL2R为引物进行扩增，获得条带单一的特异性野生型目的片段；将目的片段稀释至1万‑10万倍，终浓度为10‑20ng/μL，作为检测野生型阴性对照模板用；突变型目的片段的获取:突变型目的片段的获取分为两步，第一步利用带有突变位点的突变引物BCL2F和BCL2MR、BCL2MF和BCL2R获得突变位点前后两段突变片段；第二步将这两段突变片段连接起来，构成突变型目的片段；所述将这两段突变片段连接起来，是利用部分重复的突变位点前后的两个DNA片段混合起来作为模板，而利用最开始的那对引物BCL2F和BCL2R将两个小片段连接起来，其产物即含有所述的突变点，获得突变型目的片段；所述M/W＝1％阳性对照模板的获取：混合99μL野生型模板和1μL突变型模板，配制100μL突变型/野生型＝1％的混合模板，作为检测用1％阳性对照模板；2)10μL反应体系检测：取25mM MgCl₂1.2μl,2μM BCL2F1μl，2μM BCL2R1μl，H₂O1.3μl，加入0.5μl模板DNA，5μl2×HRM荧光master，按qPCR‑HRM检测的程序进行检测；结果分析及判定：通过HRM方法，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。