一种噬菌体抗体库及其在盐酸克伦特罗含量测定中的应用

摘要

本发明提供了一种噬菌体抗体库及其在盐酸克伦特罗含量测定中的应用，是通过在噬菌体质粒pIT2的SalI和NotI酶切位点之组装抗体轻链可变领域的基因VL，在SfiI和XhoI酶切位点之间组装抗体重链可变领域基因VH构建，抗体的基因是由利用牛血清蛋白与盐酸克伦特罗偶联物免疫小鼠后得到；该抗体为单链抗体文库与牛血清蛋白与盐酸克伦特罗偶联物亲和富集，开发盐酸克伦特罗的单克隆抗体将其应用盐酸克伦特罗残留量的检测。本发明利用该抗体库可直接取得高亲和力的抗盐酸克伦特罗及具有与盐酸克伦特罗相似结构的化学物质的抗体，在盐酸克伦特罗及具有相似结构的化学物质的抗体开发及检测方面具有广泛的应用前景。

主权项

一种噬菌体抗体库，其特征在于：在pIT2载体的SfiI和XhoI酶切位点之间组装抗体重链的可变领域基因，在SalI和NotI酶切位点之间组装抗体轻链的可变领域基因，然后通过大肠杆菌作为增幅的宿主而制作，该抗体库中盐酸克伦特罗特异性抗体可以通过利用针对盐酸克伦特罗与牛血清蛋白偶联物的淘筛而富集，进而开发单克隆的抗盐酸克伦特罗的抗体，噬菌体抗体库的质粒的构建为：① 利用盐酸克伦特罗和牛血清蛋白的偶联物免疫Balb/c小鼠后，摘取小鼠的脾脏，从脾脏中提取总RNA，并以其为模板，以Oligo(dT)6为引物合成cDNA第一链；②利用设计合成的抗体特异性引物经RT‑PCR分别扩增抗体重链可变领域（VH）的基因和抗体轻链可变领域（VL）的基因；抗体重链正向引物为：     5’‑TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTYCAGCTBCAGCAGTC‑3’     5’‑TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTTCACCTGCAGCARTC‑3’    5’‑TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTRCAGCTGAAGGAGTC‑3’     5’‑TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCCAACTVCAGCARCC‑3’     5’‑TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGATCCAGTTGGTVCAGTC‑3’      5’‑TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGSASTC‑3’     5’‑TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGSKGGTGGAGTC‑3’     5’‑TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAARSTTGAGGAGTC‑3’     5’‑TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAKGTSVAGCTTCAGGAGTC‑3’    5’‑TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAASSTGGTGGAATC‑3’    5’‑TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTGRTGGARTC‑3’    5’‑TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTGAAGCTGRTGGAGTC‑3’    5’‑TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAGTGCAGCTGTTGGAGAC‑3’    5’‑TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTGAAGCTTCTCSAGTC‑3’    5’‑TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCARGTTACTCTGAAAGAGT‑3’；抗体重链反向引物为：      5’‑ACTGCTCGAGACGGTGACCGTGGTCCC‑3’      5’‑ACTGCTCGAGACTGTGAGAGTGGTGCC‑3’      5’‑ACTGCTCGAGACAGTGACSCAGAGTCCC‑3’      5’‑ACTGCTCGAGACGGTGACTGAGGTTCC‑3’；抗体轻链正向引物为：     5’‑TATTCGTCGACGGATATTGTGATGACBCAGDC‑3’      5’‑TATTCGTCGACGGATRTTKTGATGACCCARAC‑3’      5’‑TATTCGTCGACGGAAAATGTGCTCACCCAGTC‑3’      5’‑TATTCGTCGACGGAYATTGTGATGACACAGTC‑3’     5’‑TATTCGTCGACGGACATCCAGATGACACAGAC‑3’     5’‑TATTCGTCGACGGAYATTGTGCTSACYCARTC‑3’      5’‑TATTCGTCGACGGACATCCAGATGACYCARTC‑3’     5’‑TATTCGTCGACGCAAATTGTTCTCACCCAGTC‑3’；抗体轻链反向引物为：    5’‑TTCTCGTGCGGCCGCACGTTTKATTTCCAGCTTGG‑3’      5’‑TTCTCGTGCGGCCGCACGTTTTATTTCCAACTTTG‑3’      5’‑TTCTCGTGCGGCCGCACGTTTCAGCTCCAGCTTGG‑3’；用于检测目标基因的插入的两个载体特异性引物M13RV，pHENseq为：M13RV：5’‑GGAAACAGCTATGACCATG‑3’，pHENseq：5’‑CTATGCGGCCCCATTCA‑3’；以上引物中，S=G/C，S代表G或者C；R=A/G; Y=C/T; B=C/G; K=G/T; D=A/G/T; V=A/C/G；③纯化PCR增幅产物后使用相应的限制酶处理基因并将其与pIT2载体连接，然后转化大肠杆菌，噬菌体抗体库中含有具有核苷酸序列的基因及氨基酸序列的抗体，在噬菌体抗体库中：增幅的抗体重链可变领域（VH），抗体轻链可变领域（VL）基因为以小鼠脾脏总RNA为模板，以抗体重链可变领域（VH），抗体轻链可变领域（VL）相应的引物混合物为引物，运用一步法增幅而得；抗体重链可变领域（VH）基因增幅引物含有SfiI和XhoI酶切点，抗体轻链可变领域（VL）基因的增幅引物含有SalI和NotI酶切位点。