奶山羊乳房炎病原菌多重PCR检测试剂盒的制备方法

摘要

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种奶山羊乳房炎病原菌多重PCR检测试剂盒的制备方法。一种奶山羊乳房炎病原菌多重PCR检测试剂盒的制备方法为：1）待检样本DNA提取；2）设置PCR检测试剂盒；3）PCR扩增；4）PCR扩增产物分析。本发明对对提高乳房炎的检测、监控水平，保障羊奶及其奶制品食品安全具有重要意义。

主权项

一种奶山羊乳房炎病原菌多重PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的制备方法为：1）待检样本DNA提取；2）设置PCR检测试剂盒：由PCR试剂管、阳性对照、阴性对照、Taq DNA聚合酶、溴酚蓝上样缓冲液组成；3）PCR扩增：在PCR检测管中加入预处理的DNA样本及Taq DNA聚合酶，同时设置阳性、阴性对照，微量移液器吹打混匀后瞬间高速离心，PCR仪进行扩增反应；    4）PCR扩增产物分析：将上述PCR扩增产物进行凝胶电泳，与阳性、阴性对照比较待检样本所出现的电泳条带，以判断待检样品是否为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌、无乳链球菌、克雷伯氏菌的单一或混合感染；所述的步骤3）中的PCR进行扩增反应的反应循环条件为：95 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，60.5 ℃退火90 sec，72 ℃延伸1 min，30个循环后72 ℃延伸8 min，保存PCR产物于4 ℃待检；所述的多重PCR检测试剂盒是以原有的PCR检测技术为基础，将多个单一PCR置于同一反应体系、同一反应条件中进行，同时达到对多种致病菌的检测；多重PCR检测试剂盒的引物为：a、菌种：大肠杆菌；特异性因子：wecA；上/下游引物：GTGGTTCGACGGGCAAACCAGCCTC  CGACGGTACATAATCGCCACCATAT；扩增片段：264；b、菌种：停乳链球菌；特异性因子：16S–23S间隔区；上/下游引物：TGGAACACGTTAGGGTCG  AACTAGAAAAACTCTTGATTATTC；扩增片段：256；c、菌种：金黄色葡萄球菌；特异性因子：nuc；上/下游引物：TCACAAACAGATAACGGCGTAAATAG  CACTTGCTTCAGGACCATATTTCTC；扩增片段：235；d、菌种：无乳链球菌；特异性因子：cfb；上/下游引物：CGACCTTTTGGACAAGTAGTAAGATACC GGAGTTGTCACTTGATCAGCATGTAC；扩增片段：199；e、菌种：乳房链球菌；特异性因子：pauA；上/下游引物：CACAATTATTAACACGAGATCGACG  TCAGTAGGATGAGTGATAGGTTCTTCA；扩增片段：151；f、菌种：克雷伯氏菌；特异性因子：khe；上/下游引物：GGAAGTGTGGATAAACGGCT CTCCTGCTCGGTGTTATTGA；扩增片段：109。