一种银杏酚酸的生物降解方法

摘要

一种银杏酚酸的生物降解方法，利用漆酶LacC，按比例，当降解体系中含有一定浓度的银杏酚酸，添加漆酶LacC的浓度为0.004U/mL-0.006U/mL，降解体系的pH4.0-6.0，降解温度为45℃～60℃，降解处理时间为10～24小时。单纯的用漆酶对银杏酚酸进行降解，其降解效率不到30%，加入介体物质后，特别是加入ABTS后，其降解效率最高可达100%。

主权项

一种银杏酚酸的生物降解方法，其特征在于利用漆酶LacC，降解体系中漆酶LacC的浓度为0.004U/mL‑0.006U/mL，降解体系的pH4.0‑6.0，降解温度为45℃～60℃，降解处理时间为10～24小时，降解体系中添加有终浓度0.1～1mM的2，2’‑联氮‑二(3‑乙基‑苯并噻唑‑6‑磺酸)二铵盐(ABTS)，所述漆酶LacC由下述方法制得：培养栓菌(Trametes versicolor)，培养基为：麸皮20g/L，葡萄糖5g/L，酒石酸铵120mmol/L，200mmol/L pH5.0柠檬酸缓冲液，1mmol/L愈创木酚，0.1mL Tween80，0.3mmol/L Cu²⁺，培养条件为28℃培养5d；将1L培养好发酵液置于10000rpm的冷冻离心机中4℃下离心10min收集上清液即为漆酶粗酶液；然后在上清液中加入终浓度为80％wt的硫酸铵，在4℃下放置24h后置于10000rpm的冷冻离心机中4℃下离心30min，沉淀用20mM pH7.5Tris‑HCl buffer溶解透析；透析处理过的酶液进行DEAE Sepharose^TM CL‑6B离子交换柱层析，采用平衡液：20mM pH7.5Tris‑HCl buffer，洗脱缓冲液：20mM pH7.0Tris‑HCl buffer，NaCl的浓度梯度为0‑0.6mol/L，洗脱体积为800mL，洗脱速度：1.5mL/min，每4mL收集一管检测漆酶活性，通过蛋白检测仪检测到三个蛋白峰，最后一个峰所收集的为漆酶LacC；或，由下述方法制得：(1)栓菌(Trametes versicolor)的培养：培养基为PDA：葡萄糖20g/L，马铃薯汁20％wt，接种新鲜的栓菌菌丝，28℃下180rpm培养3‑4天过滤收集菌丝体；(2)栓菌总RNA的提取：取收集的栓菌的菌丝体用PBS缓冲溶液清洗后，在液氮下研磨菌丝体至粉末状，收集到2mL离心管中，加入1mL Trizol后剧烈震荡，4℃下12000g离心10min后转移上清液至2mL离心管，加入200μL氯仿震荡15s混匀后30℃下孵育2‑3min，4℃下12000g离心10min取上层清夜，加入上清液0.8倍体积的异丙醇混匀后4℃下12000g离心10min，去净上清后用75％wt乙醇水溶液清洗2次后4℃下7500g离心5min得到沉淀，使其自然干燥后，加入DEPC水溶解RNA沉淀，作为模板RNA，‑20℃下保存；(3)栓菌cDNA的合成：以栓菌总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA第一链：在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer反应液：上述反应液混匀后在50℃下保温1h，70℃下保温15min后冰上冷却，得到的反应液立即用于cDNA第二链的合成；(4)栓菌基因的克隆：设计LacC引物，载体为pPICZαB：P9:GGGGAATTCATGGGCAAGTTTCACTCTTTTGTGAA；P10:GGGTCTAGATCAGAGGTCGGACGAGTCCAAA；基因LacC的克隆利用引物P9和P10，反应条件为94℃，5min；暂停计时，加Ex Taq聚合酶，加40μL石蜡油密封；30次循环(94℃，30s；58℃，30s；72℃，90s)；72℃，10min；反应停止，4℃保温；得到基因LacC，用EcoR I，Xba I酶切，同时表达载体也用相同的酶分别酶切，基因LacC和酶切后的载体分别连接过夜，转化大肠杆菌，得到重组质粒pPICZαB‑LacC；(5)重组漆酶LacC的制备：将重组质粒pPICZαB‑LacC线性化后，电转化毕赤酵母得到重组菌，将重组酵母菌划线于YPD平板上进行活化，28℃培养2天，至长出单菌落后接种于10mL BMGY液体培养基中，于30℃，200r/min摇床培养48h，OD₆₀₀达2～6，3000rpm离心5min收集菌体，弃上清，用无菌纯净水洗涤菌体1～2次；将菌体用BMMY诱导培养基稀释至OD₆₀₀＝1，用4层纱布代替棉花塞，于28℃，180r/min摇床培养，每天补加甲醇至终浓度为0.6％(V/V)；将培养好的培养基置于10000rpm的冷冻离心机中4℃下离心10min收集上清液即为漆酶粗酶液；首先超滤装置对漆酶粗酶液浓缩；然后在浓缩液中加入终浓度为80％wt的硫酸铵，在4℃下放置24h后置于10000rpm的冷冻离心机中4℃下离心30min，沉淀用20mM pH7.0Tris‑HCl buffer溶解透析；透析处理过的酶液进行DEAE Sepharose^TMCL‑6B离子交换柱层析，采用平衡液：20mM pH7.0Tris‑HCl buffer，洗脱缓冲液：含0.4、0.6、1.0M的20mM pH7.0Tris‑HCl buffer，洗脱速度：0.5mL/min，每6min收集一管，检测漆酶活性，得到重组漆酶LacC。