一种Hib多糖与精制破伤风类毒素偶联工艺

摘要

本发明公开了一种Hib多糖与精制破伤风类毒素偶联工艺，它包括Hib多糖-AH衍生物生成和Hib多糖-TT结合物制备两个步骤，Hib多糖-AH衍生物生成包括以下子步骤：A1、多糖溶解，A2、多糖活化，A3、加入ADH进行连接，A4、去除CNBr和ADH；Hib多糖-TT结合物制备包括以下子步骤：B1、加入TT溶液，B2、加入EDAC，B3、去除EDAC，得到多糖-TT偶联物；B4、将多糖-TT偶联物分离纯化，洗脱，除菌过滤，得到多糖-TT结合物。本发明的有益效果是：提高了工作效率，省工省时，同时，节约了NaCl溶液的用量；本发明与传统工艺采用的透析相比，减少了样品被污染几率。

主权项

一种Hib多糖与精制破伤风类毒素偶联工艺，它包括Hib多糖‑AH衍生物生成和Hib多糖‑TT结合物制备两个步骤，所述的Hib多糖‑AH衍生物生成包括以下子步骤：A1、多糖溶解，称取Hib多糖，加入灭菌后的注射用水溶解多糖；A2、多糖活化，按0.2～0.6倍Hib多糖的量加入CNBr进行活化；A3、Hib多糖‑AH衍生物的生成，加入ADH进行连接；A4、提纯，将生成的Hib多糖‑AH衍生物提纯；所述的Hib多糖‑TT结合物制备包括以下子步骤：B1、多糖‑AH 衍生物与TT混合，在多糖‑AH 衍生物溶液中加入TT溶液，充分混匀后加入EDAC；B2、去除EDAC，去除EDAC，得到多糖‑TT偶联物；B3、分离纯化，将多糖‑TT偶联物分离纯化得到多糖‑TT结合物；其特征在于：（1）多糖溶解中Hib多糖的终浓度为1～3mg/ml；（2）多糖活化中Hib多糖和CNBr反应的pH为9.5～10.5，反应时间为20～30min；（3）Hib多糖‑AH衍生物的生成中加入ADH的量为Hib多糖量的2～5倍，Hib多糖与ADH反应的pH为7.5～8.5，反应时间为20～30min；（4）提纯的具体方法为：用30～50KD的膜包，先用0.02～0.05mol/L的NaCl按1:1的体积比进行稀释，然后超滤至1/2体积，反复稀释和超滤10～15次，完成后，用0.45μm滤膜过滤，即为多糖‑AH衍生物； （5）多糖‑AH 衍生物与TT混合的具体方法为：在多糖‑AH 衍生物溶液中加入等体积的浓度为1～3mg/ml的TT溶液，充分混匀，在2～8℃温度下反应20～30min，在pH为5.0～6.0时加入EDAC，充分混匀，并维持pH在5.0～7.0间反应1.5～2个小时；（6）去除EDAC的方法为：用30～50KD的膜包，0.1～0.3mol/L的NaCl循环超滤5～10次；（7）分离纯化的具体方法为：将多糖‑TT偶联物经Sepharose 4FF凝胶柱分离纯化，用0.1～0.15mol/L的NaCl溶液洗脱，收集V0起始部分的高分子偶联物，并将收集到的洗脱液进行除菌过滤，得到多糖‑TT结合物，并置于2～8℃下保存。