肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法

摘要

本发明公开了肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法，方法：色谱仪为岛津LC-20AT高效液相色谱仪，固定相反相C18柱（SHIMADZU VP-ODS 5um 150*4.6mm），流动相A液为50mmol/L乙酸钠溶液（PH=6.50）：乙腈=97：3，流动相B液为乙腈：水=2:1，柱温40℃，检测波长254nm，洗脱时间24min，流速1ml/min，进样量5μl，结果：谷氨酰胺(Gln)的保留时间为10.144min，检出限为0.19mg/L（S/N=2），定量限为0.95mg/L（S/N=10）线性范围172.3～689.5mg/L，R²=0.9995，日间精密度RSD值均不大于2.34%。结论:通过对肉鸽不同组织及血液进行合理处理，用高效液相色谱仪能够快速、准确测定肉鸽血液、肌肉及十二指肠的谷氨酰胺(Gln)含量，为基础研究和临床应用研究提供有效的技术和数据支持。

主权项

肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）衍生化试剂的配制：分别配制100mM的异硫氰酸苯酯和1M的三乙胺备用；（2）色谱柱的制备：色谱仪为岛津LC‑20AT高效液相色谱仪，固定相反相C18柱（SHIMADZU  VP‑ODS  5um  150*4.6mm），流动相A液为50mmol/L乙酸钠溶液（PH=6.50）：乙腈=97：3，流动相B液为乙腈：水=2:1；（3）标准液的制备：取10ml谷氨酰胺(Gln)加入到25 ml容量瓶，用纯水溶解定溶，放入4℃冰箱保存，并逐级稀释至3/4、1/2的浓度，2倍浓度现配现用；（4）标准液的测定和标准液测定结果处理：将步骤（3）中标准液300μl加入1.5 ml离心管中，然后加入步骤（1）中的150 μl异硫氰酸苯酯和150μl三乙胺，混合室温反应一小时，加600 μl正己烷萃取杂质，15000 pm/min离心5min取下层清液，用步骤（2）的色谱柱进行测定，柱温40℃，检测波长254nm，洗脱时间24min，流速1 ml/min，进样量5μl；制定标准曲线和标准品色谱图；（5）取样：分别从乳鸽血液、胸部肌肉和十二指肠中取样，具体来讲，血液中谷氨酰胺取样步骤：乳鸽静脉采血2ml加入到含肝素的离心管，在转速2800 pm/min温度 4℃下离心10 min，取0.4ml血液注入到20 mgSSA（5‑磺基水杨酸）样品管中，涡旋混合后，迅速在液氮中冷却，然后在‑80℃保存；胸部肌肉中谷氨酰胺取样步骤：乳鸽16 d颈静脉放血后，腹部毛清理干净，剥离腹部皮肤，采集胸部肌肉，用剪刀剪成0.5 mm块，放入EP管中，迅速在液氮中冷却，然后在‑80℃保存待测； 十二指肠中谷氨酰胺(Gln)取样步骤：打开乳鸽腹腔，取出十二指肠，放于平皿中，剖开十二指肠，露出肠粘膜，除去上层肠内容物，用手术刀片刮取肠粘膜层，放入EP管中，迅速在液氮中冷却，然后在‑80℃保存待测；（6）试验样品的处理：血液样品的处理：将SSA血液样品从‑80℃取出并在室温下解冻后，在3000g（5790RPM）4℃条件下离心15min，以去除蛋白沉淀，上清液转入样品管后置于样品架于4℃保存备用；肌肉和十二指肠粘膜组织样品的处理：肌肉、十二指肠粘膜组织样品在‑80℃取出，称取样品0.2 g，用0.2 ml PBS（磷酸盐缓冲液）作稀释液，匀浆器中研磨，用1.0ml 0.66M冰冻后的高氯酸进行匀浆200s，匀浆后的样品于4℃、RCF为3000g离心5min，取0.8 ml上清液用0.4ml 0.66M磷酸钾中和，形成的高氯酸钾沉淀离心除去（4℃RCF为3000g离心5min）离心后的上清液在‑20℃保存备用；（7）试验样品的衍生反应和测定：分别取步骤（6）处理过的三类样品各300μl放入三个对应的1.5 ml离心管中，然后分别加入步骤（1）中的150 μl异硫氰酸苯酯和150μl三乙胺，混合室温反应一小时，加600 μl正己烷萃取杂质，15000 pm/min离心5min取下层清液，用步骤（2）的色谱柱进行测定，柱温40℃，检测波长254nm，洗脱时间24min，流速1 ml/min，进样量5μl；（8）试验结果的处理：分别对血液样品、肌肉和十二指肠粘膜组织样品制定谷氨酰胺曲线色谱图并得出结论。