Asia1型口蹄疫重组病毒及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种对宿主无致病性的Asia1型口蹄疫重组病毒及其制备方法和应用，拯救系统为基因工程构建的能够表达精确口蹄疫病毒基因组RNA的高效真核质粒，借此能够构建和制备口蹄疫重组病毒，使用上述质粒可以制备出高滴度和抗原匹配性好的疫苗株，既可以做为活疫苗，也可以制备成灭活苗，免疫猪和牛后可有效刺激机体产生免疫应答，并提供猪和牛体免疫保护作用，能够有效保护GV和GII流行毒株，免疫保护率能达100%，半数保护剂量（PD₅₀）在6.34～13.59，具有效价高、与流行毒株的抗原匹配性高、抗原谱广、免疫保护率高、对宿主猪和牛无致病力，且不形成血毒症，不排毒的优点，可用于我国及其周边国家Asia1型口蹄疫病毒的预防和控制。

主权项

一种Asia1型口蹄疫重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤1）、Asia1型口蹄疫重组病毒感染性克隆的构建：以O型口蹄疫病毒的拯救系统为骨架，通过AflII和ClaI限制性内切酶，将含有部分L和P12A基因的序列用Asia1/HN/06毒株相应基因SEQ ID NO:2替换，得到prAsia1‑FMDV的重组质粒；所用Asia1/HN/06毒株是2006年4月分离于河南周口，经BHK‑21传代培养10代，保藏于农业部兽医局指定保存单位：国家口蹄疫参考实验室；使用RNAeasy Mini Kit提取Asia1/HN/06毒株的总RNA，用引物oligNot I反转录合成病毒第一链cDNA，以合成的第一链cDNA为模板，用引物Asia1P12A‑F和Asia1P12A‑R扩增获得Asia1/HN/06毒株部分L和P12A的基因片段，上述三条针对ASIA1/HN/06株的特异性引物分别是：oligNot I：5'‑ttttctagagcggccgct₃₈‑3'Asia1P12A‑F：5'‑ttttccttaagggacaagaacatgctgtgtttgcctgtgt‑3'Asia1P12A‑R：5'‑actcacatcgatgtcaaagtgaaacctcc‑3'，上游引物Asia1P12A‑F中含AflII限制性酶切位点；下游引物Asia1P12A‑R中含下划线部分的ClaI限制性酶切位点，上述特异性引物扩增Asia1/HN/06毒株部分L和P12A基因获得的基因序列为SEQ ID NO:2，大小为3582 bp，扩增反应体系为50μL，扩增条件为：94℃ 5min，94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 3min30s，go to 2，35个循环，72℃ 10min，PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳核实后进行纯化回收并送交测序，获得上述基因片段的DNA；prO/CHA/99是含有O/CHA/99毒株全长cDNA的质粒，其中，O/CHA/99毒株是O型口蹄疫毒株，1999年分离于中国香港，现保存于国家口蹄疫参考实验室，prO/CHA/99质粒组成是在病毒基因组5'端上游含人巨细胞病毒RNA聚合酶II启动子及编码牛生长素多聚苷酸化信号的修饰剪切序列，在其两者间含鼠源RNA聚合酶I启动子；在病毒基因组3'端下游含鼠源聚合酶终止子I和聚合酶终止子II序列；及嵌合在O型口蹄疫病毒O/CHA/99全长cDNA基因组两端的榔头锤酶和丁型肝炎酶的核心序列，其中丁型肝炎酶共有88个核糖核酸，自我剪切修饰位点在5'末端G处；榔头锤酶核心序列共有58个核糖核酸，自我剪切修饰位点在3'末端C处，将含O型口蹄疫病毒O/CHA/99基因组的感染性克隆转染至受体细胞中，通过RNA聚合酶II启动子和RNA聚合酶I启动子调控元件分别转录包装出病毒RNA前体，再经HamRz 和HdvRz的修饰剪切产生具有感染性的病毒RNA，将O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99与上述得到的Asia1/HN/06毒株部分L和P12A片段，分别用AflII和ClaI双酶切后，连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含Asia1/HN/06毒株部分前导蛋白L和结构蛋白P12A的重组质粒，将重组质粒命名为prAsia1‑FMDV；对猪和牛无致病性的Asia1型口蹄疫重组病毒的感染性克隆的构建：①Asia1型口蹄疫重组病毒自然受体识别位点RGD突变成RSD，其感染性克隆构建过程是：将用引物Asia1P12A‑F和Asia1P12A‑R扩增获得Asia1/HN/06毒株部分L和P12A的基因片段，基因序列为SEQ ID NO:2，与pMD20‑T载体4℃连接过夜，连接产物转化JM109感受态细胞，测序鉴定阳性克隆，获得重组质粒命名为pMD20‑Asia1P12A；以鉴定正确的重组质粒pMD20‑Asia1P12A为模板，用磷酸化突变引物S‑P和RSD‑P进行PCR扩增，上述5'磷酸化的点突变引物分别是：S‑P：5'‑cacgcagagtgagcaaccggctgcc‑3'RSD‑P：5'‑cgagggcggcaagatcgctacgccgcgagg‑3'，在以上的磷酸化的点突变引物中，将Asia1/HN/06毒株部分L和P12A基因序列中受体结合位点RGD点突变为RSD，用该引物进行平末端扩增，纯化回收PCR产物，经室温连接5min后，转化大肠杆菌JM109，测序鉴定点突变后的阳性克隆，将得到的定点突变重组质粒命名为pMD20‑Asia1P12A‑RSD；将O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99与上述得到的Asia1/HN/06毒株部分L和P12A片段上受体结合位点经过点突变后的pMD20‑Asia1P12A‑RSD，分别用AflII和ClaI双酶切，基因序列为SEQ ID NO:1，连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含Asia1/HN/06毒株受体结合位点突变为RSD后的部分L和P12A的重组质粒，将重组质粒命名为prAsia1‑RSD‑FMDV；②Asia1型口蹄疫重组病毒L基因SAP区域(SAF‑A/B, Acinus, and PIAS)突变，其感染性克隆构建过程是：将表达质粒pCDNA3.1(+)用特异性引物进行扩增，得到含有PacI和AflII酶切位点的基因片段，上述引物分别是：pCD‑AflII‑ApaI‑F：5'‑ttttccttaaggggcccgtttaaacccgctgat‑3'pCD‑PacI‑NheI‑R：5'‑cttacttaattaagctagccagcttgggtctcccta‑3'，同时将O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99，经PacI和AflII双酶切后，与上述得到的含有PacI和AflII酶切位点的pCDNA基因片段连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含O/CHA/99株5’UTR和部分L基因的重组质粒，将重组质粒命名为pCD‑OL；以鉴定正确的重组质粒pCD‑OL为模板，用磷酸化突变引物F‑P和SAP‑P进行PCR扩增，上述5'磷酸化的点突变引物分别是：F‑P：5'‑gacctcacagggcttgaactgcacga‑3'SAP‑P：5'‑ctccgcctgcttggcggctgcaagcgtg‑3', 在以上的磷酸化的点突变引物中，将O/CHA/99株L基因中SAP区域进行突变，用此对引物进行平末端扩增，纯化回收PCR产物，经室温连接5min后，转化大肠杆菌JM109，测序鉴定点突变后的阳性克隆，将得到的定点突变重组质粒命名为pCD‑OL‑SAP；将已获得含Asia1/HN/06毒株受体结合位点突变为RSD的重组质粒prAsia1‑RSD‑FMDV与上述得到的O/CHA/99株L基因中SAP区域进行突变后的重组质粒pCD‑OL‑SAP，分别用PacI和AflII双酶切后，连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含Asia1/HN/06毒株受体结合位点突变为RSD并且L基因中SAP区域突变的重组质粒， 将重组质粒命名为prAsia‑RSD‑SAP‑FMDV；步骤2）、Asia1型口蹄疫重组质粒转染敏感细胞BHK‑21细胞或IBRS‑2细胞，拯救获得所述Asia1型口蹄疫重组病毒。