超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及检测方法

摘要

一种超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及其检测方法，包括HS-CRP反应板，HS-CRP检测缓冲液，HS-CRP ID芯片；所述的HS-CRP检测缓冲液是指含荧光标记的小鼠抗人HS-CRP的单克隆抗体和含荧光标记的羊抗兔IgG；所述的HS-CRP反应板包括吸水纸，硝酸纤维素膜，样品垫，PVC底板，小鼠抗人CRP的单克隆抗体，兔IgG。其目的是提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及其检测方法。

主权项

超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其特征在于：包括HS‑CRP反应板，HS‑CRP检测缓冲液，HS‑CRP ID芯片；所述的HS‑CRP检测缓冲液是指含荧光标记的小鼠抗人HS‑CRP的单克隆抗体和含荧光标记的羊抗兔IgG；所述的HS‑CRP反应板包括吸水纸，硝酸纤维素膜，样品垫，PVC底板，小鼠抗人CRP的单克隆抗体，兔IgG；所述HS‑CRP反应板采用如下步骤制成：(1)、取3.44gNa₂HPO₄H₂O，100g蔗糖，2.1g吐温20(TWEEN‑20)，10gPVPK‑30，全部加入1L烧瓶中，再向加入1L烧瓶中800ml纯化水，充分搅拌混匀；(2)、向加入1L烧瓶中加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH，控制pH在7.40‑7.45范围内，定容至1000ml；(3)、取20ml步骤(2)得到的液体，加入到50ml烧杯中，再向50ml烧杯中加入4mg小鼠抗人CRP抗体，编号AB2，使抗体的终浓度为0.2mg/ml；(4)、取20ml步骤(2)得到的液体，加入到另一个50ml烧杯中，加入6mg兔IgG，使兔IgG终浓度为0.3mg/ml；(5)、取硝酸纤维素膜(NC膜)，将其裁剪为宽为2.5cm的长条，长条的一端设定为A端，另一端设定为B端，将步骤(3)制得的液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在距A端1.4cm处划线即为检测线；将步骤(4)制得的液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在距A端1.1cm处划线即为质控线；(6)、将步骤(5)制备的硝酸纤维素膜(NC膜)在37度下干燥至少2小时，干燥环境湿度恒定在20％以下；(7)、将硝酸纤维素膜(NC膜)的非点样面粘帖在PVC底板上，将样品垫裁剪为2cm宽的长条，粘帖于B端的PVC底板上，覆盖硝酸纤维素膜(NC膜)B端2mm，将吸收垫裁剪为1.8cm宽的长条，粘帖于A端的PVC底板上，覆盖硝酸纤维素膜(NC膜)A端约5mm，用滚刷轻压已粘帖好的检测版；(8)、用剪切机从A端到B端裁剪为3mm宽的检测条，装壳，并将壳与干燥剂一同放入铝箔袋，抽真空并封口，即得HS‑CRP反应板；所述HS‑CRP检测缓冲液采用如下步骤制成：(1)、准备1mg含荧光标记的小鼠抗人CRP的单克隆抗体，编号AB1，使用Sephadex G25层析柱用0.2M NaHCO₃ pH9.0溶液进行脱盐处理，收集脱盐液2.5ml，将其浓缩为2ml，终浓度为1mg/ml；(2)、用0.2M NaHCO₃ PH9.0溶液配置0.5mg/ml的Alexa Fluor610溶液，并将其转移到棕色玻璃瓶中；(3)、按照以下公式计算需要加入的0.5mg/ml的Alexa Fluor610的体积抗体量(mg)X0.102(ml/mg)＝0.5mg/ml Alexa Fluor610的体积，此处需要加入0.102ml Alexa Fluor610(4)、在室温下搅拌混匀16小时；(5)、使用Sephadex G25层析柱用0.2M NaHCO3pH9.0溶液对步骤(4)制备的液体进行脱盐处理，将收集液用0.2MM滤器过滤后收集于棕色玻璃瓶中，共2.5ml，得到1号过滤液；(6)、准备1mg含荧光标记的羊抗兔IgG，编号AB2，使用Sephadex G25层析柱用0.2MNaHCO₃pH9.0溶液进行脱盐处理，收集脱盐液2.5ml，将其浓缩为2ml；终浓度为1mg/ml：(7)、用0.2M NaHCO₃PH9.0溶液配置0.5mg/ml的Alexa Fluor610溶液，并将其转移到棕色玻璃瓶中；(8)、按照以下公式计算需要加入的0.5mg/ml的Alexa Fluor610的体积抗体量(mg)X0.102(ml/mg)＝0.5mg/ml Alexa Fluor610的体积，此处需要加入0.102ml Alexa Fluor610(9)、在室温下搅拌混匀16小时；(10)、使用Sephadex G25层析柱用0.2M NaHCO3pH9.0溶液对步骤(9)制备的液体进行脱盐处理，将收集液用0.2MM滤器过滤后收集于棕色玻璃瓶中，共2.5ml，得到二号过滤液；(11)、配置100ml0.01M的pH7.2的PBS，然后向PBS中添加2g的BSA，向PBS中添加0.3g的吐温20(TWEEN‑20)，向PBS中添加0.04g的casein，得到制备液；(12)、将步骤(5)所得的液体按照1份一号过滤液：1500份制备液的比例添加到步骤(11)制备的液体中，将步骤(10)所得的液体按照1份二号过滤液：500份制备液的比例添加到步骤(11)制备的液体中，即得HS‑CRP检测缓冲液。所述的HS‑CRPID芯片采用以下步骤制成：将HS‑CRP标准曲线，质控及批号信息用读写器通过读写软件写入外购的ID芯片，即得HS‑CRP ID芯片。