| 摘要 |
Przedmiotem wynalazku jest eukariotyczny wektor ekspresyjny pcDNA3-ANG-1 o wzorze- ogólnym 1, w którym, do plazmidu pcDNA3, wstawiony jest fragment cDNA dla angiopoetyny-1, mający sekwencję kodującą dla tego genu, z kodonem ATG, stanowiącym sygnał do rozpoczęcia procesu replikacji oraz z kodonem TGA będącym sygnałem jego zakończenia, opartą na sekwencji zdeponowanej w Banku Genów pod numerem NM_001146, ponadto jest ograniczony dodatkowymi sekwencjami restrykcyjnymi dla enzymów NheI oraz MluI. Przy czym plazmid pcDNA3, zbudowany jest z 5446 nukleotydów oraz fragmentu sekwencji cDNA dla angiopoetyny-1, umieszczonej w orientacji sens względem promotora CMV. Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania eukariotycznego wektora ekspresyjnego pcDNA3-ANG-l, który polega na tym, że otrzymuje się bibliotekę cDNA przy pomocy starterów oligo(dT) na matrycy całkowitego RNA, izolowanego z niedotlenionej ludzkiej tkanki mięśniowej serca. W drugim etapie, amplifikuje się na matrycy cDNA sekwencję genu dla angiopoetyny-1, metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), przy pomocy dwóch unikatowych starterów, startera FORWARD, zawierającego sekwencję nukleotydową, rozpoznawaną przez enzym restrykcyjny NheI oraz startera REVERSE, zawierającego sekwencję nukleotydową, rozpoznawaną przez enzym restrykcyjny MluI. Produkt amplifikacji wbudowuje się do wektora plazmidowego pSC-B-amp/kan (Stratagene) z użyciem topoizomerazy I, otrzymany konstrukt DNA wprowadza się do bakterii kompetentnych Escherichia coli, uzyskany fragment DNA, odpowiadający ANG-1, wprowadza się do wektora ekspresyjnego pcDNA3, w odpowiednie miejsca restrykcyjne plazmidu pcDNA3. Wynalazek dotyczy też zastosowania eukariotycznego wektora ekspresyjnego pcDNA3-ANG-1, do wytwarzania leku do terapii domięśniowej chorych cierpiących na krytyczne niedokrwienie kończyn dolnych oraz chorych z trudno-gojącymi się ranami. |
