一种用于检测阪崎肠杆菌的分子马达生物传感器试剂盒

摘要

一种用于检测阪崎肠杆菌的分子马达生物传感器试剂盒属于动物源性食品微生物快速检测领域，主要解决传统检测方法时间过长(5～6天)。本发明的核心技术是利用载色体Chromatophore上的F₀F₁-ATPase分子马达生物传感器，F₀F₁-ATP合酶由于能快速地旋转，通过旋转它建立了催化位点与质子转运之间的偶联。首先在ATP合酶的ε亚基上连接ITS探针，将待测样品和阴性对照分别与生物传感器结合后，比较其催化ATP合成10分钟后的ATP产生量，ATP合成的多寡可以通过环境中H+的量进行测量，而H⁺的多寡通过F-DHPE所体现的荧光强度大小来获得。本试剂盒可对待测样本中的阪崎肠杆菌进行快速、灵敏、高通量的检测。

主权项

一种用于检测阪崎肠杆菌的分子马达生物传感器试剂盒，包含下述组分：其中，所述分子马达生物传感器为Chro‑ITS，其构建方法为：根据阪崎肠杆菌ITS基因设计特异性核酸探针5’‑ACTCTGACACACCGCGCATTCCTG，其中探针的5’用生物素进行标记，将该探针通过生物素抗体连接在分子马达上面：将生物素标记的ε亚基抗体结合在F₀F₁‑ATPase的ε亚基上，然后用链霉亲和素(Streptavidin)与ε亚基抗体上的生物素结合，最后将生物素标记的探针与链霉亲和素结合；应用所述分子马达生物传感器试剂盒检测阪崎肠杆菌的步骤包括：1)取1.5mlEP管，加入待测样本10μl；2)将上述EP管置于95℃水浴中5min，然后转移至50℃水浴1min；3)取2μlchroinvA，用合成buffer稀释到一定的倍数，取稀释后的chro10μl加入上述EP管；4)另取1个EP管加入10μl无菌水置于95℃水浴5min，然后转移至50℃水浴1min，再加入10μl合成buffer作为本底对照，短暂振荡使反应体系混匀；5)再向2个EP管中分别加入30μl启动buffer，启动buffer由1.6mol/l的ADP与合成buffer按体积比1∶3配制，每次实验按需要取一定的量配制，现用现配，振荡使反应体系混匀，然后立即短暂离心以除去管盖内壁上的水珠；6)将上述反应体系放入37℃恒温摇床中温育10min；7)将EP管从摇床中取出，分别加入200μlPBS缓冲液，振荡使体系混匀；8)取一块干净的96孔板，将2管中的最终反应体系加入其中，每个体系加3孔，每孔加样50μl，然后对每个加样孔分别加入30μl已配置好的荧光素酶溶液，所述荧光素酶溶液配制方法为：将荧光素酶/荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶/荧光素的棕色玻璃瓶中，盖上瓶塞，反复颠倒几次混匀，不可振荡，使用前应将混合液在室温放置1h；用枪反复吹打几次使体系混匀；9)将96孔板上机检测，处理数据，对各组数据取平均值，然后用样本数值减去本底数值即为样本的实际荧光值。