一种酶联检测试剂盒及其制备方法

摘要

一种检测人血管内皮生长因子（VEGF）的酶联检测试剂盒。试剂盒盒体内包括：VEGF受体包被的酶联反应板、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体加保护剂配置的酶结合物、作为阳性对照的VEGF蛋白的冻干粉、作为阴性对照的蛋白冻干粉、样品稀释液、PBST浓缩洗液、3，3^＇,5,5^＇-四甲基联苯胺配置的显色底物、作为终止液的2MH₂SO₄、封板胶纸。本试剂盒可用于癌症、血管病、糖尿病视网膜病及类风湿关节炎的诊断和预后，具有准确、特异、灵敏、稳定、方便等优点。

主权项

一种酶联检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述酶联检测试剂盒的组成为：酶联板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、酶联物、浓缩洗涤液、显色剂A&B、终止液和封板胶纸；其中，酶联板为血管内皮细胞生长因子受体包被的酶联反应板；酶联物为辣根过氧化物酶标记血管内皮细胞生长因子单克隆抗体，该单克隆抗体通过如下步骤进行制备、纯化及标记：以小鼠为免疫动物，重组VEGF为抗原进行免疫，根据小鼠免疫效价，挑选免疫效价最高的动物，取脾脏进行细胞融合，采用间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞株的筛选，挑选有一个细胞团的阳性孔进行有限稀释，一个孔中只有此一个克隆细胞团，中央密集成圆形向四周铺开，待有限稀释的所有的孔皆如此且全部检测为阳性，可认为克隆完成，由其中单一细胞来源的杂交瘤分泌所得到的抗体为单克隆抗体，正辛酸‑硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体，纯度在95％以上，采用戊二醛法将辣根过氧化物酶(HRP)标记到VEGF单克隆抗体上；所述重组VEGF用昆虫细胞表达并用Ni柱纯化；阳性对照为血管内皮细胞生长因子蛋白冻干粉；阴性对照为动物血清冻干粉；样品稀释液为0.05％吐温‑20，1％牛血清白蛋白，10mM乙二胺四乙酸二钠，0.05％硫柳汞，0.4M NaCl，pH6.5；浓缩洗涤液为137mM NaCl，2.7mM KCl,10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄,0.05％吐温‑20,pH7.4；显色剂A、B，其中A液为H₂O₂溶液，B液为3,3,5,5‑四甲基联苯胺溶液；终止液为2M H₂SO₄；其中，该酶联检测试剂盒的制备方法包括以下主要步骤：(a)将血管内皮细胞生长因子受体包被于固体支持物酶联反应板上；(b)用封闭液封闭；其中，步骤(a)所述的血管内皮细胞生长因子受体用昆虫细胞表达，所述昆虫细胞为sf9、sf21、sf158或c127细胞株。