反相-高效液相色谱对人体血液和尿液中草酸浓度的测定方法

摘要

本发明公开了一种反相-高效液相色谱测定人体血液和尿液中草酸浓度的方法，属于用色谱法分析材料领域，本发明包括血液和尿液的预处理、血液和尿液的衍生处理、高效液相色谱操作条件、草酸工作曲线的制备以及血液和尿液中草酸含量的测定。本发明以邻苯二胺为衍生剂，与尿液与血液中草酸反应，生成具有强紫外吸收化合物——2，3-二羟基喹喔啉，此衍生物在314nm有强吸收峰，且与草酸具有一一对应的浓度关系，草酸的保留时间为7.2min，此峰高与浓度具有良好的线性关系，因而能准确测定人体尿液与血液中草酸的含量。本发明方法简单快速，数据准确可靠，为检测草酸浓度提供了良好的检测手段。

主权项

一种反相‑高效液相色谱对人体血液和尿液中草酸浓度的测定方法，其特征在于：包括以下步骤： a.样品预处理①血液预处理，禁食12h后上肢静脉血3ml，加入肝素抗凝后，4℃离心，取上层血浆1ml，加入1ml乙睛和50μl pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，混旋，离心，37℃的N₂气流将上层液中的乙睛蒸发掉，用去离子水补足液体至1ml；②尿液预处理，24h尿液与浓盐酸按体积比100:1酸化尿液，置于4℃中备用；b.样品衍生处理取经预处理的血浆上清液0.5ml，另取经预处理的尿液1ml，分别置于带盖离心管中进行衍生处理，所述衍生处理是向离心管中加入5μl浓盐酸和0.5ml 10g/L的邻苯二胺标准液，140℃加热30min，室温冷却，用5mol/L NaOH溶液调节其pH值为5‑6，离心后的上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，上机测定；c. 高效液相色谱操作条件仪器：Aligent 1100型高效液相色谱仪；色谱柱：150mm×4.6mm，5μm，Agilent XDBC₁₈；预柱：4.6mm×12.5mm，5μm，Agilent Zorbax extend‑ C₁₈；流动相组成体积比：甲醇∶醋酸胺水溶液=15:85；流速：1.2ml·min^‑1；检测器：紫外可见光多波长检测器；柱温：26.3℃；进样量：50μL；草酸的保留时间：7.2min；d.草酸工作曲线的制备取正常人经预处理的血浆，另取正常人经衍生处理的尿液，分别制成草酸血浆溶液以及草酸尿溶液，浓度均分别为125 mg/L，62.5 mg/L，31.25 mg/L，15.625 mg/L，7.813 mg/L，1.953mg/L；对各个浓度的草酸血浆溶液、草酸尿溶液、空白血浆、空白尿液进行衍生处理后，进行色谱分析，以峰面积A对浓度C进行线性回归，得血液中草酸工作曲线：A=12.8289C+3.239,  r=0.9995；尿液中草酸工作曲线：A=11.343C+56.599,  r=0.9993；e.血液和尿液中草酸含量的测定将经过衍生处理的待测血液和尿液样品上机测定，根据待测血液和尿液样品的对应峰面积由工作曲线计算出待测血液和尿液样品中草酸的浓度。